Benchtop imobilizada cromatografia de afinidade Metal, reconstituição e ensaio de um Polyhistidine Tagged Metalloenzyme para o laboratório de graduação

1. preparação para a purificação Preparação do extrato bruto sem célula Obter um centrifugado ~ 9-10 g de Escherichia coli (BL21) que overexpressed Metaloproteína polyhistidine marcado25 em um tubo cónico de 50 mL. Adicione 5 mL por grama de tampão de Lise temp/bind de quarto (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazol 10 mM, pH 8) para a ~ 9-10 g de centrifugado para um volume total ~ 45-50 mL. Periodicamente o vórtice para incentivar a dissolução. Se o pellet foi congelado, descongele em banho de água morna. Utilizando banho de gelo, esfriar a suspensão de células para ~ 3 ° C, em preparação para a lise celular.Nota: Neste ponto, lise celular por sonication, trituração de grânulo ou outro método é possível. Trituração do grânulo é demonstrada aqui porque é rápido, relativamente barato e não exige proteção de orelha. Monte um grânulo de 50ml moagem câmara de acordo com as instruções do fabricante. Encha a câmara de moinho do grânulo meio cheio de refrigerados 0,1 grânulos de vidro de mm que foram armazenados a-20 ° C. Preencher o restante da câmara com a suspensão de eritrócitos refrigerados e usar o tampão de Lise/bind de 4 ° C para encher a câmara completamente. Use uma espátula pequena para girar o eixo do moinho do grânulo e a suspensão de células se misturam com os grânulos. Remover quaisquer bolhas grandes com uma pipeta e em seguida Atarraxe a tampa. Seque a câmara de fugas. Adicionar cerca de 1 xícara de gelo para a jaqueta clara, plástica, inverter a câmara preenchida 50 mL para a jaqueta cheia de gelo e parafuso fechado. Fixe a câmara de gelo-encamisado no motor. Transformar o moinho do grânulo motor por 15 segundos a 15.800 rpm e, em seguida, deixe para descansar por 45 segundos. Repita 8 vezes. Quando os 8 ciclos completos, decante a suspensão de lise de toda a célula para uma de 50 mL ou maior tubo de centrifugação de alta velocidade (25.000 x g ou superior). Coloca um par de tubos equilibrados na centrífuga e girar a 25.000 x g por 40-45 minutos a 4° C para granular célula grânulos de detritos e vidro.Nota: Se 50 mL ou tubos de maiores Pontuação: para centrifugação de alta velocidade não estiverem disponíveis, retire os grânulos de vidro por centrifugação a 1000 a 2000 x g por 2-3 min em um tubo cônico de 50 mL para produzir um volume menor de suspensão de células (~ 25 mL) que pode ser decantado para um menor volum tubo e avaliado por centrifugação de alta velocidade. Quando centrifugação é completa, decante os extratos claros, amarelos, sem célula, brutos em um tubo cónico de 50ml limpo. Tome cuidado para não transferir quaisquer detritos de células. Colete uma pequena amostra dos extratos brutos sem célula para posterior análise da purificação por SDS-PAGE26. Preparação da coluna IMAC Obter uma coluna de 1,5 x 20 cm, equipada com um suporte inferior da cama para reter as partículas de resina, uma tomada de fechamento de Luer e uma tampa superior que também contém um encaixe de Luer lock. Encaixe na tomada do conector Luer-lock com uma torneira de passagem para controlar o fluxo. Trabalhando para a bancada, firmemente monte a coluna em uma posição de anel. Obter uma pasta de 50% de resina de (Ni-NTA) ácida nitriloacetic níquel-limite em 20% de etanol foi armazenado a 4 ° C. Agite suavemente o frasco para uniformemente Ressuspender a resina. Trabalhando em temperatura ambiente- e sobre a bancada, uso estabeleceu-se uma pipeta graduada para retirar 2 mL do chorume, que renderá 1 mL de resina capaz de ligação 50-60 mg de polyhistidine tagged proteína e transferir o chorume para a coluna. Abra a torneira e deixe a solução de armazenamento em excesso para drenagem por gravidade da resina. Fechar a torneira com segurança Usando uma pipeta Pasteur, cuidadosamente adicionar tampão de Lise/bind refrigerados (50 mM fosfato, 300 mM NaCl, imidazol 10 mM, pH 8) e a coluna de resina – pelo menos 30 mL. Tome cuidado para não perturbar a superfície da resina. Execute o buffer as paredes da coluna para evitar salpicos. Equilibrar a resina, permitindo que o buffer de Lise/bind drenar lentamente da coluna por gravidade para um copo de coleção. Quando o tampão de Lise/bind principalmente drenou, fechar a torneira para interromper o fluxo de buffer quando ~ 5 mL de tampão de Lise permanece acima da resina e deixar a coluna, montada na vertical, até que esteja pronto para continuar, ou por até 1 semana. 2. purificação do alvo Polyhistidine-marcados por IMAC Prepare o tampão de lavagem (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, pH 8 do imidazole de 20 mM) e o tampão de eluição (50mm fosfato, 300 mM de NaCl, imidazol 250 mM, pH 10% glicerol 8). Relaxar a 4° C. Prepare a coluna do Ni-NTA para a adição dos extratos brutos sem célula, abrindo a torneira e permitindo que o restante de tampão de Lise/ligação para drenagem por gravidade através da resina Ni-NTA. Quando drenou toda a reserva, e a superfície da resina é exposta, feche a torneira. O bruto grátis celular usando uma pipeta Pasteur, cuidadosamente pipeta extrai para a resina, tomando cuidado para não perturbar a superfície. Execute os extratos brutos as paredes da coluna para evitar salpicos. O volume de extratos brutos aplicado é dependente do nível de expressão da proteína polyhistidine-tag; assegurar que o volume total de extratos crus contém 50-60 mg ou menos de proteína alvo por mL de resina Ni-NTA (consulte a etapa 1.2.4). Quando todos os extratos brutos foram transferidos para a coluna, abra a torneira para que a coluna pode drenar por gravidade. Este fluxo através de é composto por proteínas que se não ligam para a resina – coletar 100 μL para posterior análise da purificação por SDS-PAGE. 26 A viscosidade dos extratos brutos sem célula pode diminuir o fluxo de gravidade da coluna consideravelmente. Para aumentar a taxa de fluxo, aplica um simples “mão-bomba”: Pegue uma seringa de 10ml Luer-lock e conectá-lo à tampa da coluna usando um comprimento curto de tubo plástico e encaixes Luer-lock entre a tampa de coluna e a seringa. Retire o êmbolo da seringa e em seguida, encaixar firmemente a tampa da coluna na parte superior da coluna. Comprima suavemente o êmbolo da seringa enquanto manualmente, avaliar a taxa de fluxo através da recolha de eluente em um cilindro graduado; taxas de 1 a 2 mL por minuto são compatíveis com a resina e esta configuração. Delicadamente aumente a compressão do êmbolo da seringa como retarda a taxa de fluxo. Para evitar a introdução de ar na resina, retire a tampa da coluna anexado bomba manual quando o menisco do líquido aplicado atinge 5 a 10 mm acima da cama de resina e permitir que o volume restante para drenagem por gravidade. Quando os extratos brutos livre de célula tem terminado a drenagem e a superfície da resina é exposta novamente, use uma pipeta Pasteur cuidadosamente Adicionar 30 mL de tampão de lavagem refrigerado à coluna – tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Execute o buffer as paredes da coluna para evitar salpicos. Abra a torneira e permitir que o tampão de lavagem drenar através da coluna. Este processo é remover proteínas fracamente acopladas da resina. Descarte o eluente. Enquanto o tampão de lavagem está drenando, preparar dezesseis, rotulado, microcentrifuga tubos para a coleta de frações de 1 mL. Quando o tampão de lavagem tem drenado e a superfície da resina é exposta novamente, feche a torneira. Use uma pipeta Pasteur cuidadosamente Adicionar 30 mL de tampão de eluição refrigerados à coluna – tomando cuidado para não perturbar a superfície da resina. Execute o buffer as paredes da coluna para evitar salpicos. Abra a torneira lentamente e permitir que o buffer de eluição para eluir a proteína polyhistidine marcado da coluna. Colete 1 mL de eluente em cada um dos tubos microcentrifuga marcado, 1 a 16. Teste as frações de proteínas usando o reagente e/ou instrumento fabricantes27,28um ensaio colorimétrico proteína tais como o ensaio de Bradford ou espectroscopia UV-visível de acordo com os métodos específicos. Como mostrado aqui, o ensaio colorimetric usando azul de Coomassie é reduzido a um volume de 100 μL para sacrificar apenas um pequeno volume de cada fração. Mix 3 μL de cada fração com 100 µ l de uma proteína colorimétrica do ensaio reagente e manualmente, observar a formação de qualquer cor para indicar a presença de proteína na fração; detecção com um espectrômetro não é necessária. Se a proteína é encontrada na fração 16, continue farmacológicos frações de 1 mL e ensaio para proteína periodicamente, até as frações eluted já não contêm uma quantidade significativa de proteína. Combinar proteína contendo frações em um tubo limpo cônico e retirar uma amostra de 100 μL para posterior análise por SDS-PAGE26. Prosseguir com a reconstituição do cofactor do íon do metal ou congelar a proteína em alíquotas de 3 mL a-80 ° C. Certifique-se que 10% de glicerol é incluído na eluição buffer é um crioprotetor para estabilizar a proteína pura durante o congelamento. Quando a eluição da coluna Ni-NTA é completa, ou seja, toda a proteína é a coluna e recolhidos em frações, passar outro 25 mL de tampão de eluição através da coluna e armazenar a coluna a 4 ° C em ~ 5 mL de tampão de eluição para armazenamento a curto prazo , ou tampão de Lise/bind com 20% de etanol para o armazenamento de longo prazo. 3. reconstituição da proteina alvo com Fe2 + Adição de Fe2 +Nota: Necessita de um ferro não-heme (II) vinculação da enzima, tais como a l-dopa dioxigenase neste exemplo, um íon2 + Fe para atividade; no entanto, o ferro (II) oxida prontamente ao ferro (III), que está inativo, e uma fração da proteína purifica sem qualquer ferro em tudo. Para iniciar a reconstituição do metal, obter 3 mL da enzima purificada suspendida em tampão de eluição. Se congelado, descongelar rapidamente através de um banho de água morna e uma vez descongelado, coloque a proteína no gelo. Usando o volume de proteína no tubo, calcule a quantidade de ascorbato de sódio (198.1 g/mol) necessário para fazer a concentração final de 12,5 mM na amostra. Além disso, calcule a quantidade de ditiotreitol (DTT, 154.25 g/mol) necessário para fazer a concentração final de 12,5 mM na amostra. Adicione o ascorbato de sódio sólido e TDT e suavemente, mas completamente, misture até para dissolver completamente. Tome cuidado para não causar precipitação de proteínas com mistura excessivamente agressivo. Adicione uma pequena quantidade de sulfato de ferro (II) hepta (MW 278.01 g/mol) para a amostra de proteína. A fim de obter uma quantidade bastante pequena da torneira sal, ferro 1 alguns milímetros grânulos de Filipa4•7H,2O sólido para fora em um pedaço de papel de pesar, dobram o papel sobre o grânulo e esmagá-lo com o lado liso de uma espátula de metal. Adicione um grão do pó resultante para o tubo de proteína. Vórtice de misturar e uma rosa cor-de-rosa aparecerá no tubo. Incube a solução-de-rosa da proteína, tampada, por 10-30 minutos no gelo. A cor rosa vai desaparecer lentamente ao longo do tempo. Filtração de gel Use uma coluna de filtração de gel embalada com 10 mL de gel de poliacrilamida esférico com um limite de exclusão de peso molecular de aproximadamente 6.000 e uma variedade de tamanho de partícula hidratado de 90 – 180 µm em uma coluna de 1.5 x 12 cm, que também é equipada com um reservatório de 10 mL. Certifique-se a coluna está equipada com o mais baixo e oferece suporte a cama superior sob a forma de 30 discos de polietileno poroso hum para reter a resina na coluna e impedir a cama de resina seco executado. Monte a coluna de filtração de gel para uma posição de anel. Se utilizar uma coluna de filtração de gel de pré-embalados, retire a tampa e despeje o buffer excesso acima do apoio da cama superior. Para equilibrar a coluna, comece por encher o reservatório com buffer compatível com subsequente do ensaio e armazenamento, por exemplo, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% de glicerol em pH 8.0. Se utilizar uma coluna de filtração de gel de pré-embalados, arrancar a ponta inferior da coluna de filtração de gel para iniciar o fluxo de buffer e expor o encaixe de deslizamento de Luer. Caber uma torneira de passagem para o fim de deslizamento de Luer da coluna, mas deixá-la aberta e permitir que a coluna a escorrer pela gravidade. Quando o buffer tem drenado da coluna e o apoio de cama superior é exposto, fechar a torneira e adicionar o ~ 3 mL de metalloenzyme o Fe (II) reconstituído à coluna pipetando a solução sobre o suporte da cama superior exposta. Abra a torneira e permitir que a amostra inteira 3,0 mL inserir a coluna por gravidade. Descarte esses primeiros 3 mL de eluente. Qualquer cor de rosa que se forma quando manusear a solução ficará preso no topo da coluna. Quando a coluna parou de pingar e o apoio de cama superior é exposto, adicione 4 mL de tampão de gel filtração (por exemplo, 50mm NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% de glicerol em pH 8.0) para a coluna. Abra a torneira e coletar o eluente em tubos microcentrifuga sobre oito fracções de 0,5 mL. Teste as frações de proteína usando um ensaio colorimétrico da proteína ou UV-Vis27,28 , conforme descrito anteriormente. Combine proteína contendo frações. Retire uma amostra para análise de SDS-PAGE26. Prosseguir com o ensaio ou armazenamento da amostra.