Banco inmovilizado cromatografía de afinidad metálica, reconstitución y ensayo de un Polyhistidine etiquetada metaloenzima para el laboratorio pregrado

1. preparación para la purificación Preparación del extracto crudo sin células Obtener un precipitado de células de g ~ 9-10 de e. coli (BL21) que sobreexpresa la etiqueta del polyhistidine metalloprotein25 en un tubo cónico de 50 mL. Añadir 5 mL por gramo de tampón de lisis/bind temperatura habitación (50 mM fosfato, 300 mM de NaCl, imidazol de 10 mM a pH 8) ~ 9-10 g de precipitado de células para un volumen total ~ 45-50 mL. Periódicamente vortex a disolución. Si el pellet se congela, descongela en un baño de agua tibia. Usando el baño de agua helada, enfriar la suspensión de células a ~ 3 ° C en la preparación de lisis celular.Nota: En este punto, es posible lisis celular por sonicación, molienda del grano o cualquier otro método. Molienda de grano se demuestra aquí porque es rápido, relativamente barato y no requiere protección para los oídos. Montar un cordón de 50 mL fresado según las instrucciones del fabricante. Llenar la cámara de molino de grano la mitad llenos de frío 0,1 granos de cristal de mm que se han almacenado a-20 ° C. Llene el resto de la cámara con la suspensión de células refrigeradas y buffer de lisis/bind de 4 ° C para llenar completamente la cámara. Utilice una pequeña espátula para girar el eje del molino de grano y la suspensión de células se mezclan con los granos. Eliminar las posibles burbujas grandes con una pipeta y luego atornille la tapa. Seco de la cámara de cualquier fuga. Añadir aproximadamente 1 taza de hielo a la chaqueta claro, plástico, incorporar la cámara de llenado de 50 mL a la chaqueta llena de hielo y el tornillo cerrado. Sujete la cámara con cubierta de hielo en el motor. Apague el motor en el molino de bolas durante 15 segundos a 15.800 rpm, luego dejar para reposar durante 45 segundos. Repetir 8 veces. Cuando terminan los 8 ciclos, decantar la suspensión de lisis de la célula entera en un tubo más grande clasificado para la centrifugación de alta velocidad (25.000 x g o superior) o 50 mL. Coloque un par de tubos equilibrados en la centrifugadora y vuelta a 25.000 x g durante 40-45 minutos a 4° C para que sedimenten residuos y cristal cuentas de celular.Nota: Si no dispone de 50 mL o más grandes tubos de centrifugación de alta velocidad, quitar los granos de cristal por centrifugación a 1000-2000 x g durante 2-3 minutos en un tubo cónico de 50 mL para obtener un menor volumen de suspensión celular (~ 25 mL) que puede decantar en un volumen más pequeño tubo e clasificada para la centrifugación de alta velocidad. Al terminar la centrifugación, decantar los extractos en un tubo cónico de 50 mL limpio claro, amarillo, sin células, crudos. Tenga cuidado de no para transferir los residuos de la célula. Recoger una pequeña muestra de los extractos crudos libres de células para su posterior análisis de la purificación por SDS-PAGE26. Preparación de la columna IMAC Obtener una columna de 1,5 x 20 cm equipada con un soporte inferior de la cama para retener las partículas de resina, una toma de la cerradura de Luer y una tapa superior que también contiene un tipo Luer lock. Encaja en el tomacorriente de la Luer-cerradura con una llave de paso para controlar el flujo. Trabajar en el Banco, Monte firmemente la columna en un soporte de anillo. Obtener una mezcla de 50% de níquel-limite nitriloacetic la resina del ácido (Ni-NTA) en etanol al 20% que ha sido almacenada a 4 ° C. Agitar suavemente la botella para resuspender uniformemente la resina. Trabajando a temperatura ambiente y en el escritorio, uso una pipeta graduada a retirar 2 mL de la mezcla, que producirá 1 mL de colocado resina capaz de atar 50-60 mg de polyhistidine etiquetado proteína y transferir la mezcla a la columna. Abra la llave de paso y deje que la solución de almacenamiento de exceso de drenaje por gravedad de la resina. Cierre la llave de paso bien Con cuidado utilizando una pipeta Pasteur, añadir tampón de lisis frío/bind (50 mM fosfato, 300 mM de NaCl, imidazol de 10 mM a pH 8) y a la columna de resina – por lo menos 30 mL. Tenga cuidado de no para perturbar la superficie de la resina. Ejecutar el buffer por las paredes de la columna para evitar salpicaduras. Equilibre la resina al permitir que el tampón de lisis/bind drene lentamente la columna por gravedad en un vaso de colección. Cuando el búfer de lisis/bind ha drenado sobre todo, cerrar la llave de paso para detener el flujo de buffer cuando ~ 5 mL de tampón de lisis se mantiene por encima de la resina y dejar la columna, montada verticalmente, hasta que esté listo para continuar, o hasta 1 semana. 2. purificación del Polyhistidine-etiqueta meta por IMAC Preparar el tampón de lavado (50 mM fosfato, 300 mM de NaCl, pH de imidazol 20 mM 8) y tampón de elución (50 mM fosfato, 300 mM de NaCl, imidazol de 250 mM, glicerol al 10% pH 8). Enfriar a 4° C. Preparar la columna Ni-NTA para la adición de los extractos crudos libres de células abriendo la llave de paso y permitiendo el restante buffer de lisis/obligatorio para drenar por gravedad a través de la resina de Ni-NTA. Cuando se ha vaciado el buffer, y se expone la superficie de la resina, cierre la llave de paso. Utilizando una pipeta Pasteur, pipeta extrae el crudo libre de la célula en la resina, teniendo cuidado de no para perturbar la superficie. Ejecutar los extractos crudos abajo las paredes de la columna para evitar salpicaduras. El volumen de extractos crudos aplicado es dependiente en el nivel de expresión de la proteína del polyhistidine-etiqueta; asegurar el volumen total de extractos crudos contiene 50-60 mg o menos de la proteína diana por mL de resina Ni-NTA (ver paso 1.2.4). Cuando todos los extractos crudos se han transferido a la columna, abra la llave de paso para que la columna puede drenar por gravedad. Este flujo a través de está compuesto por proteínas que no se unen a la resina – recoger 100 μL para su posterior análisis de la purificación por SDS-PAGE. 26 La viscosidad de los extractos crudos libres de células puede reducir considerablemente el flujo de la gravedad de la columna. Para aumentar la velocidad de flujo, aplicar un simple “bomba de mano”: Tome una jeringa de 10 mL Luer-lock y conecte a la tapa de la columna usando un tramo corto de tubería plástica y conexiones Luer-lock entre la tapa de la columna y la jeringa. Extraer el émbolo de la jeringa y luego ajuste bien la tapa de la columna en la parte superior de la columna. Comprimir suavemente el émbolo de la jeringa mientras evaluar manualmente el caudal por recoger el eluyente en una probeta graduada; las tasas de 1-2 mL por minuto son compatibles con la resina y esta configuración. Irá aumentando la compresión del émbolo de la jeringa como la tasa de flujo disminuye. Para evitar la introducción de aire en la resina, retirar la tapa de la columna une bomba de mano cuando el menisco del líquido aplicado alcanza 5-10 mm por encima de la capa de resina y permite el volumen restante drenar por gravedad. Cuando los extractos crudos libres de células han terminado el drenaje y la superficie de la resina se expone otra vez, utilice una pipeta Pasteur cuidadosamente agregar 30 mL de tampón de lavado frío a la columna, teniendo cuidado de no para perturbar la superficie de la resina. Ejecutar el buffer por las paredes de la columna para evitar salpicaduras. Abra la llave de paso y permitir que el tampón de lavado al desagüe a través de la columna. Este proceso es quitar las proteínas débilmente consolidadas de la resina. Deseche el eluyente. Mientras que el tampón de lavado está drenando, preparar dieciséis, etiquetado, tubos de microcentrífuga para recoger fracciones de 1 mL. Cuando se haya drenado todo el tampón de lavado, y la superficie de la resina se expone otra vez, cerrar la llave de paso. Utilice una pipeta Pasteur para añadir cuidadosamente 30 mL de tampón de elución refrigerados a la columna, teniendo cuidado de no para perturbar la superficie de la resina. Ejecutar el buffer por las paredes de la columna para evitar salpicaduras. Abrir la llave de paso lentamente y permitir que el tampón de elución eluir la proteína polyhistidine con la etiqueta de la columna. Recoger 1 mL de eluyente en cada uno de los tubos de microcentrífuga marcada, 1 a 16. Prueba de las fracciones de proteína mediante un ensayo colorimétrico de proteína como el ensayo de Bradford o espectroscopia UV-Visible de acuerdo con los métodos específicos de reactivo o instrumento fabricantes27,28. Como se muestra aquí, el ensayo colorimétrico con azul de Coomassie es reducido a un volumen μL 100 para sacrificar solamente un pequeño volumen de cada fracción. Mezcla 3 μL de cada fracción con 100 μl de una proteína colorimétrica reactivo de ensayo y manualmente, observar la formación de cualquier color para indicar la presencia de proteína en la fracción; no es necesaria la detección con un espectrómetro. Si la proteína se encuentra en la fracción 16, continúe liberador de fracciones de 1 mL y análisis para la proteína periódicamente, hasta que las fracciones eluídas ya no contienen una cantidad significativa de proteína. Fracciones que contienen proteínas se combinan en un tubo cónico limpia y retirar una muestra de 100 μL para su posterior análisis por SDS-PAGE26. Proceder a la reconstitución del cofactor iones metálicos o congelar la proteína en alícuotas de 3 mL a-80 ° C. Asegurar que glicerol al 10% se incluye en la elución buffer es un crioprotector para estabilizar la proteína pura durante la congelación. Elución de la columna de Ni-NTA es completa, es decir, la proteína es la columna y en fracciones, pasar otros 25 mL de tampón de elución a la columna y almacenar la columna a 4 ° C en ~ 5 mL de tampón de elución para almacenamiento a corto plazo , o tampón de lisis/bind con 20% de etanol para el almacenamiento a largo plazo. 3. reconstitución de la proteína de la blanco con el Fe2 + Adición de Fe2 +Nota: Un hierro no hemo (II) enlace enzima, como la l-dopa dioxigenasa en este ejemplo, requiere un ión de Fe2 + para la actividad; sin embargo, el hierro (II) se oxida fácilmente al hierro (III), que es inactivo, y una fracción de la proteína se purifica sin cualquier hierro a todos. Para empezar la reconstitución del metal, obtener 3 mL de la enzima purificada suspendida en tampón de elución. Si se congela, descongelar rápidamente a través de un baño de agua tibia y una vez descongelados, puesto la proteína en el hielo. Mediante el volumen de la proteína en el tubo, calcular la cantidad de ascorbato de sodio (198.1 g/mol) necesario para que la concentración final 12.5 mM en la muestra. También, calcular la cantidad de Ditiotreitol (DTT, 154.25 g/mol) necesario para que la concentración final 12.5 mM en la muestra. Añadir el ascorbato de sodio sólido y TDT y suavemente pero a fondo, mezclar para disolver totalmente. Tenga cuidado de no para causar precipitación de proteínas con una mezcla demasiado agresiva. Agregue una pequeña cantidad de hierro (II) sulfato heptahidrato (MW 278.01 g/mol) a la muestra de proteína. Para obtener una cantidad bastante pequeña del toque de sal, hierro 1 unos mm gránulos de FeSO4•7H2O sólido hacia fuera en un pedazo de pesan papel, doblan el papel sobre el gránulo y aplastar con la parte plana de una espátula de metal. Añadir un grano del polvo resultante en el tubo de la proteína. Vortex para mezclar y una rosa color rosa aparece en el tubo. Incubar la solución rosa de proteína, capsulada, de 10 a 30 minutos en hielo. El color rosa se desvanecerá lentamente con el tiempo. Filtración de gel Utilice una columna de gel filtración con 10 mL de gel de poliacrilamida al esférico con un límite de exclusión del peso molecular de aproximadamente 6.000 y un rango de tamaño de partícula hidratada de 90 – 180 μm en una columna de 1,5 x 12 cm, que también está equipada con un depósito de 10 mL. Asegúrese de que la columna está equipada con inferior y superior de la cama apoya en forma de 30 discos de Umm poroso de polietileno para retener la resina en la columna y evitar que la capa de resina seco. Monte la columna de gel filtración en un soporte de anillo. Si utiliza una columna de filtración de gel envasado, retire la tapa y quite el exceso de tampón sobre el soporte superior de la cama. Para equilibrar la columna, comience por llenar el depósito con buffer compatible con posterior análisis y almacenamiento de información, por ejemplo, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, glicerol al 10% a pH 8.0. Si utiliza una columna de filtración de gel envasado, quite la punta inferior de la columna de gel filtración para iniciar el flujo de buffer y exponer el luer deslizante. Montar una llave de paso hasta el final de la resbalón de Luer de la columna, pero dejo abierto y permitir que la columna de goteo por gravedad. Cuando el buffer se haya drenado de la columna y se expone el apoyo superior de la cama, cerrar la llave de paso y agregar el ~ 3 mL de la metaloenzima de Fe (II) reconstituido a la columna pipetear la solución en el soporte de la cama superior expuesta. Abrir la llave de paso y deje que la muestra entera 3,0 mL entrar en la columna por gravedad. Deseche estos primeros 3 mL del eluyente. Cualquier color rosa que se forma durante la manipulación de la solución será atrapado en la parte superior de la columna. Cuando la columna ha dejado de gotear y se expone el apoyo superior de la cama, agregar 4 mL de la solución de la filtración de gel (por ejemplo, 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, glicerol al 10% a pH 8.0) a la columna. Abra la llave de paso y recoger el eluyente en tubos de microcentrífuga en ocho fracciones de 0,5 mL. Prueba de las fracciones de proteína mediante un ensayo colorimétrico de proteína o de27,UV-Vis28 como se describió anteriormente. Combinar fracciones de proteína que contienen. Retirar una muestra para análisis de SDS-PAGE26. Proceder con el ensayo o el almacenamiento de la muestra.