표현과 포유류 Bestrophin 이온 채널의 정화
Summary
이온 채널의 정화는 종종 도전, 하지만 일단 달성, 그것은 잠재적으로 수 체 외에서 조사 기능 및 채널의 구조. 여기, 표현과 포유류 bestrophin 단백질, 캘리포니아2 +의 가족의 정화에 대 한 단계적 절차 설명-Cl– 채널을 활성화.
Abstract
인간 게놈 4 bestrophin paralogs를, 즉 BEST1, BEST2, BEST3, 및 BEST4 인코딩합니다. BEST1, BEST1 유전자에 의해 부호화는 캘리포니아2 +-Cl– 채널 (CaCC) 주로 망막 안료 상피 (RPE) 표시를 활성화. BEST1의 생리 및 병 적인 의미 BEST1 유전자에서 200 개 이상의 독특한 돌연변이 최고의 vitelliform 등 적어도 5 망막 퇴행 성 장애의 스펙트럼에 유전자 연결 되었다는 사실에 의해 강조 표시 됩니다. 황 반 영양 장애 (최고의 질병) 따라서, bestrophin 채널을 단일 분자 수준에서의 물리학을 이해 엄청난 의미를 보유 하고있다. 그러나, 순화 된 포유류 이온 채널을 얻는 것은 종종 어려운 작업입니다. 여기, 우리는 BacMam 잠재 유전자 전달 시스템 및 친 화력과 크기 배제 크로마토그래피에 의해 그들의 정화와 포유류 bestrophin 단백질의 표현에 대 한 프로토콜을 보고합니다. 순화 된 단백질 지질 bilayers에 결정학 electrophysiological 녹음 등 후속 기능 및 구조 분석에 활용 될 가능성이 있다. 중요 한 것은,이 파이프라인 함수 및 다른 이온 채널의 구조 연구에 적용할 수 있습니다.
Introduction
Bestrophins은 박테리아에서 인 간에1다양 한 종족을 통해 보존 하는 이온 채널의 가족 이다. 인간에서는, BEST1 유전자, 염색체 11q12.3에 있는 막 단백질 Bestrophin-1 (BEST1) 주로 눈2,3 망막 안료 상피 (RPE) 세포의 basolateral 막에 표현 되 인코딩 ,4. 585 아미노산의 첫 번째 ~ 350 높은 종 중 보존 하 고는 막 횡단 영역을 포함, 구성 BEST1 인간1,,56CaCC 역할을 합니다. 또한, 닭에 BEST1 homologs와 Klebsiella 균 으로 작동 homopentamers7,8, 진화를 통해 환경 보호의 높은 수준을 제안.
인간에서는, 200 개 이상의 돌연변이 BEST1 유전자에서 임상 bestrophinopathies1,9라는 망막 변성 질환의 그룹에 연결 되었습니다. 5 특정 bestrophinopathies 보고 되었습니다, 등 최고의 질병, 성인-발병 vitelliform 영양 장애, 상 염색체 지배적인 vitreoretinochoroidopathy, 상 염색체 열성 bestrophinopathy, 망막 화3,4 ,,1011,12,,1314. 이러한 질병 감소 시력 및 심지어 실명으로 이어질 현재 치료할 수 없습니다. 치료 트리 트 먼 트 및 잠재적으로 맞춤된 의학을 개발 하기 위하여 어떻게 이러한 BEST1 질병 유발 돌연변이 영향 BEST1 채널15의 구조와 기능 이해에 중대 하다. 이러한 목적을 위해 연구원 순화 bestrophin (와일드 타입이 돌연변이) 채널 시험관에서 분석5,8실시를 해야 합니다.
첫 번째 주요 단계는 포유류 세포에 높은 종에서 bestrophin 채널의 표현 이다. F HEK293 세포 (BacMam 시스템)의 잠재 변환 heterologously 막 단백질16,17를 표현 하는 강력한 방법으로,이 프로토콜의 강력한 표현에는 최적화 된 BacMam 벡터 (pEG BacMam)을 활용 하 여는 이 경우에 포유류 bestrophin 체 단백질18, 대상. 이 벡터는 G-단백질 결합 수용 체, 핵 수용 체, 그리고 다른 이온 채널18를 포함 하 여 다양 한 막 단백질의 표정을 위해 사용 되었습니다. 또한 생산된 단백질 결정학18적합 증거가 있다. HEK293 F 세포에서 식의 높은 수준, 단백질 수 다음 정화 크로마토그래피;를 사용 하 여 특히, bestrophins, 경우 선호도 크기 배제 크로마토그래피 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 bestrophin 채널에 대 한 미세 조정, 일단 순화 된 단백질의 기능 및 평면 지질 bilayer와 엑스레이 결정학, 각각5,8통해 구조에 대 한 다음 분석할 수 있습니다. 이러한 기술을 bestrophins 및 다른 이온 채널의 기능 및 구조 조사에 대 한 강력한 파이프라인을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 표현과 미래 생체 외에서 분석에 사용할 포유류 bestrophin 이온 채널의 정화에 대 한 유용한 파이프라인을 설명 합니다. FPLC 장치는 크기 배제 크로마토그래피에 대 한 필요, 주사기 펌프는 친화성 크로마토그래피 바인딩 하 고, 세척, 하 고, 방출 하는 등의 모든 단계에 대 한 충분 한 이다. 푸시 솔루션 (주사기)에 열을 통해 주사기 펌프를 사용할 때는 열에 공기 방울을 밀어 피하…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 NIH 교부 금 EY025290, GM127652, 및 시작 자금 로체스터의 대학에 의해 투자 되었다.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
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