Summary

Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle

Published: August 02, 2018
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Summary

Die Reinigung von Ionenkanälen ist oft eine Herausforderung, aber einmal erreicht, kann es möglicherweise erlauben, in-vitro- Untersuchungen der Funktionen und Strukturen der Kanäle. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren für den Ausdruck und die Reinigung von Säugetieren Bestrophin Proteine, eine Familie von Ca2 +-Cl Kanäle aktiviert.

Abstract

Das menschliche Genom kodiert vier Bestrophin Paralogs, BEST1, BEST2, BEST3 und BEST4. BEST1, kodiert durch das gen BEST1 ist eine Ca2 +-aktiviert Cl Kanal (CaCC) überwiegend in retinalen Pigmentepithels (RPE) ausgedrückt. Die physiologische und pathologische Bedeutung der BEST1 wird durch die Tatsache hervorgehoben, dass über 200 verschiedene Mutationen im gen BEST1 genetisch mit einem Spektrum von mindestens fünf retinalen degenerative Erkrankungen, wie Best vitelliforme verknüpft wurden Macular Dystrophie (beste Krankheit). Daher hält das Verständnis der Biophysik der Bestrophin Kanäle der Ebene der Einzelmolekül-enorme Bedeutung. Gereinigte Säugetier-Ionenkanäle zu erhalten ist jedoch oft eine große Herausforderung. Hier berichten wir über ein Protokoll für den Ausdruck von Säugetieren Bestrophin Proteine mit BacMam Baculovirus gen-Transfer-System und ihre Reinigung durch Affinität und Größe-Ausschluss-Chromatographie. Der gereinigten Proteine haben das Potenzial, in nachfolgenden funktionellen und strukturellen Analysen wie elektrophysiologische Aufnahmen im Lipid Bilayer und Kristallographie genutzt werden. Wichtig ist, kann diese Pipeline zur Untersuchung der Funktionen und Strukturen von anderen Ionenkanälen angepasst werden.

Introduction

Bestrophins sind eine Familie von Ionenkanälen konserviert durch Arten variierend von Bakterien auf Menschen1. Beim Menschen kodiert das BEST1 -Gen liegt auf Chromosom 11q12.3 das Membranprotein Bestrophin-1 (BEST1), die überwiegend in der basolateralen Membran des retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen der Augen2,3 ausgedrückt wird ,4. BEST1 fungiert bestehend aus 585 Aminosäuren, die ersten ~ 350 davon sind hoch konserviert zwischen den Arten und die transmembranen Bereich enthalten, ein CaCC Menschen1,5,6. Darüber hinaus funktionieren die homologe BEST1 bei Hühnern und Klebsiella Pneumoniae als Homopentamers7,8, was auf ein hohes Maß an Schutz im Laufe der Evolution.

Beim Menschen wurden über 200 Mutationen im gen BEST1 klinisch zu einer Gruppe von Netzhautdegeneration Krankheiten genannt Bestrophinopathies1,9verbunden. Fünf spezifische Bestrophinopathies wurden berichtet, einschließlich beste Krankheit, Altersdiabetes vitelliforme Dystrophie, autosomal dominante Vitreoretinochoroidopathy, autosomal rezessive Bestrophinopathy und Retinitis Pigmentosa3,4, ,10,11,12,13,14. Diese Krankheiten, die zu verminderter Sehkraft und sogar Blindheit führen, sind derzeit nicht behandelbar. Um therapeutische Behandlungen und potenziell personalisierte Medizin zu entwickeln, ist es wichtig zu verstehen, wie diese BEST1 krankheitsverursachende Mutationen beeinflussen die Funktion und Struktur der BEST1 Kanal15. Für diese Zwecke müssen Forscher erhalten gereinigte Bestrophin (Wildtyp und/oder Mutanten) Kanäle und Durchführung von in-vitro- Analysen5,8.

Der erste wichtige Schritt ist die Expression von Bestrophin Kanäle aus höheren Arten in Säugerzellen. Wie Baculovirus Transduktion von HEK293-F-Zellen (BacMam System) eine leistungsfähige Methode Membran Proteine16,17heterologously zum Ausdruck zu bringen ist, dieses Protokoll nutzt einen optimierte BacMam-Vektor (pEG BacMam) für robuste Ausdruck der Ziel Protein18, die in diesem Fall ein Säugetier Bestrophin Homolog ist. Dieser Vektor wurde für den Ausdruck von verschiedenen Membranproteinen, einschließlich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, Kernrezeptoren und andere Ionen-Kanäle18verwendet. Es gibt auch Hinweise, dass die produzierten Proteine für Kristallographie18geeignet. Mit hohen Ebenen des Ausdrucks in HEK293-F-Zellen können die Proteine dann mit Chromatographie gereinigt werden; insbesondere können im Falle von Bestrophins, Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie verwendet werden.

Sobald dieses Protokoll für einen Bestrophin-Kanal abgestimmt ist, kann das gereinigte Protein dann für seine Funktion und Struktur durch planare Lipid Bilayer und Röntgen-Kristallographie, jeweils5,8analysiert werden. Insgesamt stellen diese Techniken eine mächtige Pipeline für funktionelle und strukturelle Untersuchungen von Bestrophins und anderen Ionenkanälen.

Protocol

(1) Herstellung von BacMam Ausdruck Baculoviren Legen Sie die kodierende Sequenz eines gewünschten Säugetier Bestrophin Proteins in der pEG BacMam Vektor-18 mit einer Protease erkennungssequenz Tabak Etch Virus (TEV), gefolgt von einer GLP-10 x His-Tag am C-Terminus des Proteins. Transient transfizieren Sie das expressionsplasmid in Klebstoff HEK293 Zellen19,20,21,<sup cla…

Representative Results

Die Fluoreszenzintensität in vorübergehend transfiziert Klebstoff HEK293 Zellen (Abbildung 1A) ist ein guter Indikator für die geplante proteinexpressionsgrad in Suspension-f HEK293 Zellen (Abbildung 1 b). Wenn das Zielprotein nicht gut ausgedrückt ist oder MIS nach Transiente Transfektion in HEK293 Zellen lokalisiert ist, es ist empfehlenswert, das Konstrukt Ausdruck ändern (zB., die Veränderung der Position des G…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine nützliche Pipeline für Ausdruck und Reinigung von Säugetieren Bestrophin Ionenkanäle für zukünftige in-vitro- Analysen verwendet werden. Während das FPLC-Gerät für die Größe-Ausschluss Chromatographie erforderlich ist, genügt eine Spritzenpumpe für alle Schritte der Affinitätschromatographie einschließlich verbindlich, Waschen und eluierenden. Wenn Sie eine Spritzenpumpe, Push-Lösungen (in einer Spritze) durch eine Spalte verwenden, gilt es die Frühling-Seite zur…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Projekt wurde von NIH-Stipendien EY025290, GM127652 und University of Rochester Anschubfinanzierung finanziert.

Materials

HEPES Fisher Scientific AC327265000 
NaCl Fisher Scientific AC446212500
Glycerol Fisher Scientific G33-500
Imidazole Fisher Scientific AC301870010
MgCl2 Fisher Scientific AC197530010 
TCEP Fisher Scientific AA4058704 
Aprotinin Fisher Scientific AAJ63039MA
Leupeptin Fisher Scientific AAJ61188MB 
Pepstatin A Fisher Scientific AAJ20037MB
Phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific AC215740050
DDM sol-grade Anatrace D310S
DDM anagrade Anatrace D310
Sf-900 II SFM ThermoFisher 10902179
FreeStyle medium ThermoFisher 12338018
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
High pressure homogenizer Avestin Emulsiflex-C5
HisTrap column GE 17-5248-01
Superdex-200 column GE 28990944
AKTA Pure GE 29018224
Ultra-15 centrifugal filter units Millipore UFC910024
Ultra-4 centrifugal filter units Millipore UFC810024
Ultra-0.5 centrifugal filter units Millipore UFC505024
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004
Mini-PROTEAN precast gel Bio-Rad 4561084
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
PolyJet transfection reagent SignaGen SL100688
pEG BacMam vector Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute

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Cite This Article
Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).

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