哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製
Summary
イオン チャネルの浄化はしばしば困難、しかし、一度は、それが悪意のチャネルの構造と機能の生体外で調査。ここでは、式と哺乳類 bestrophin 蛋白質、Ca2 +の家族の浄化の段階的な手順を述べる-Cl–チャンネルを活性化します。
Abstract
人間のゲノムは、4 つの bestrophin paralogs、すなわち BEST1、BEST2、ベスト 3、ベスト 4 をエンコードします。BEST1の遺伝子によって符号化される BEST1 は、Ca2 +-アクティブに Cl–チャネル (CaCC) 主に網膜色素上皮 (RPE) で表されます。BEST1 の生理学的および病理学的意義がBEST1遺伝子の 200 以上の異なる変異が最高の卵黄など少なくとも 5 つの網膜変性疾患のスペクトルに遺伝的リンクされているという事実によって強調表示されます。黄斑ジストロフィー (疾患)。したがって、非常に大きな意義を保持 bestrophin チャネルを単一分子レベルでの生物物理を理解すること。ただし、精製された哺乳類のイオン チャネルを得ることはやりがいのある仕事ではしばしばです。ここで、哺乳類 bestrophin BacMam バキュロ ウイルスの遺伝子の転送システムと親和性とサイズ排除クロマトグラフィーの浄化蛋白質の表現のためのプロトコルを報告します。浄化された蛋白質脂質二重層と結晶の電気生理学的記録など、以降の機能・構造解析に活用される可能性があります。重要なは、このパイプラインは他のイオン チャネルの構造と機能を研究する合わせることができます。
Introduction
Bestrophins は、人間1細菌からさまざまな種を保存するイオン チャネルの家族です。ヒトでは、 BEST1の遺伝子、染色体 11q12.3 に位置するエンコード膜タンパク質 Bestrophin-1 (BEST1) 目2,3 の網膜色素上皮 (RPE) 細胞の基底膜で主に表される ,4。うち最初の 〜 350 種間保存性が高いと、膜貫通領域を含む、585 アミノ酸から成る BEST1 人間1,5,6に CaCC を果たします。さらに、鶏の BEST1 同族体および肺炎桿菌の両方として機能する homopentamers7、8、進化を通じて保全の高レベルを示唆しています。
ヒトでは、200 以上BEST1遺伝子変異を臨床的に bestrophinopathies1,9と呼ばれる網膜変性疾患のグループにリンクされています。ベスト病、成人発症卵黄状黄斑ジストロフィー、常染色体優性の支配的な vitreoretinochoroidopathy、常染色体優性劣性 bestrophinopathy、網膜色素変性症3,4 など 5 つの特定の bestrophinopathies が報告されています。 ,,1011,12,13,14。視力の低下、さらには失明につながるが、これらの病気、現在治療されます。治療上の処置および可能性のある個人化された薬を開発するために関数と BEST1 チャネル15の構造のこれらのBEST1病気を引き起こす突然変異の影響を理解するが重要です。これらの目的のための研究者の in vitro解析5,8を行い精製 bestrophin (野生型および変異) チャンネルを取得する必要があります。
最初の重要なステップは、哺乳類細胞における高い種から bestrophin チャンネルの式です。このプロトコルが堅牢な発現の最適化された BacMam ベクトル (BacMam pEG) を利用して F HEK293 細胞 (BacMam システム) のバキュロ ウイルス伝達はクローン膜タンパク質16,17を表現する強力な方法は、ターゲット蛋白質18, この場合 bestrophin 哺乳類ホモログであります。このベクターは、G タンパク質共役受容体、核内受容体、イオン チャンネル18など、各種の膜タンパク質の発現のために使用されています。また、作り出されたタンパク質が結晶18に適している証拠です。F HEK293 細胞における発現の高レベルの蛋白質できます、精製するクロマトグラフィー具体的には、bestrophins、場合親和性とサイズ排除クロマトグラフィーを使用することができます。
このプロトコルは bestrophin チャンネルの微調整が、浄化された蛋白質は関数と平面脂質二分子膜とそれぞれ5,8、x 線結晶構造解析による構造を分析できます。完全に、これらのテクニックは、bestrophins と他のイオン チャネルの構造と機能の調査のため強力なパイプラインを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、将来の in vitro解析に使用される哺乳類 bestrophin イオン チャネルの発現と精製に有用なパイプラインについて説明します。サイズ排除クロマトグラフィー用 FPLC デバイス、シリンジ ポンプはアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーのバインド、洗濯、溶出性などのすべてのステップのために十分。列を (注射器) でプッシュ ソリューションにシリンジ ポンプを使?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、立ち上げ資金のためのロチェスターの大学、GM127652、NIH 助成金 EY025290 で賄われていた。
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
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