التعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات
Summary
تنقية القنوات الأيونية في كثير من الأحيان تحديا، ولكن متى تحقق، فإنه من المحتمل أن يسمح التحقيقات في المختبر لوظائف وهياكل القنوات. هنا، يمكننا وصف إجراءات تدريجية للتعبير وتنقية البروتينات بيستروفين الثدييات، وعائلة من Ca2 +-تنشيط قنوات Cl– .
Abstract
بترميز الجينوم البشري بارالوجس بيستروفين أربعة، هي: BEST1، BEST2، BEST3، و BEST4. هو BEST1، مرمزة بواسطة الجين BEST1 ، Ca2 +-تنشيط Cl– قناة (كاكك) أعرب غالباً في ظهارة صباغ الشبكية (RPE). أهمية BEST1 الفيزيولوجية والمرضية وهو أبرز حقيقة أن ما يزيد على 200 الطفرات المتميزة في الجينات BEST1 ربطت وراثيا بطائفة اضطرابات التنكسية الشبكية خمسة على الأقل، مثل فيتيليفورم أفضل حثل القرنية (المرض أفضل). ولذلك، فهم الفيزياء حيوية القنوات بيستروفين على مستوى جزيء واحد يحمل أهمية كبيرة. ومع ذلك، الحصول على قنوات أيون الثدييات المنقي غالباً مهمة صعبة. هنا، نحن تقرير وضع بروتوكول للتعبير عن البروتينات بيستروفين الثدييات مع نظام نقل الجينات باكولوفيروس باكمام وعلى تنقية بتقارب وحجم الاستبعاد اللوني. تنقية البروتينات لديها القدرة على الاستفادة منها في التحليلات الوظيفية والهيكلية اللاحقة، مثل تسجيل الكهربية في دهن بيلاييرس وعلم البلورات. الأهم من ذلك، يمكن تكييفها لدراسة وظائف وهياكل أخرى قنوات أيون هذا الأنبوب.
Introduction
بيستروفينس عائلة من قنوات أيون المحافظة عليها من خلال الأنواع المختلفة من البكتيريا إلى البشر1. في البشر، وترميز الجينات BEST1 ، الموجود على كروموسوم 11q12.3، بروتين غشائي بيستروفين-1 (BEST1) التي يتم التعبير عنها في الغالب في غشاء خلايا ظهارة (RPE) صباغ الشبكية من عيون2،3 باسولاتيرال ،4. تتألف من الأحماض الأمينية 585، 350 ~ الأولى التي هي المحافظة جداً بين الأنواع وتحتوي على منطقتها transmembrane، BEST1 بمثابة كاكك في البشر1،،من56. وعلاوة على ذلك، هومولوجس BEST1 في الدجاج و الكلبسيله الرئوية تعمل هوموبينتاميرس7،8، مما يوحي بمستوى عال من المحافظة في جميع أنحاء تطور.
في البشر، وربطت ما يزيد على 200 من الطفرات في الجينات BEST1 سريرياً بمجموعة من الأمراض تنكس الشبكية تسمى بيستروفينوباثيس1،9. سجلت خمس بيستروفينوباثيس محددة، بما في ذلك المرض أفضل، فيتيليفورم الكبار-بداية ضمور وجسمية فيتريوريتينوتشورويدوباثي المهيمنة، بيستروفينوباثي مقهورة جسمية والتهاب الشبكية الصباغي3،4 ،،من1011،12،،من1314. هذه الأمراض، مما يؤدي إلى انخفاض البصر وحتى العمى، حاليا غير قابل للعلاج. من أجل تطوير العلاجات العلاجية والطب يحتمل أن تكون شخصية، أنها حاسمة لفهم كيفية تأثير هذه الطفرات المسببة للمرض BEST1 وظيفة وهيكل ل قناة BEST115. ولهذه الأغراض، يحتاج الباحثون الحصول على القنوات بيستروفين المنقي (نوع البرية و/أو متحولة) وقواعد السلوك في المختبر تحليلات5،8.
الخطوة الرئيسية الأولى هو التعبير عن قنوات بيستروفين من الأنواع أعلى في خلايا الثدييات. كما توصيل باكولوفيروس للخلايا و HEK293 (نظام باكمام) وسيلة قوية للتعبير عن هيتيرولوجوسلي غشاء بروتينات16،17، يستخدم هذا البروتوكول متجه باكمام أمثل (شماعة باكمام) لتعبير قوي عن الهدف18من البروتين، وفي هذه الحالة هومولوج بيستروفين الثدييات. وقد استخدمت هذه القوة الموجهة للتعبير عن مختلف البروتينات الغشاء، بما في ذلك مستقبلات إلى جانب البروتين ز والمستقبلات النووية الأخرى قنوات أيون18. وهناك أيضا أدلة على أن البروتينات المنتجة مناسبة لعلم البلورات18. مع مستويات عالية من التعبير في الخلايا HEK293-F، البروتينات يمكن ثم يمكن تنقية استخدام الفصل اللوني؛ على وجه التحديد، في حالة بيستروفينس، يمكن استخدام كل من تقارب وحجم الاستبعاد اللوني.
ثم بمجرد صقل لقناة بيستروفين هذا البروتوكول، يمكن أن تحلل البروتين المنقي لوظيفتها والهيكل عن طريق الدهن مستو بلير والبلورات بالأشعة السينية، على التوالي5،8. بالإجمال، توفر هذه التقنيات خط أنابيب قوية للتحقيقات الفنية والهيكلية بيستروفينس وغيرها من القنوات أيون.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول خط أنابيب مفيدة للتعبير وتنقية قنوات أيون بيستروفين الثدييات التي ستستخدم مستقبلا في المختبر التحاليل. بينما الجهاز فبلك مطلوب لحجم الاستبعاد اللوني، مضخة الحقن كافية لجميع خطوات التقارب اللوني بما في ذلك ملزم، والغسيل والتينج. عند استخدام مضخة الحقن إلى حلول د?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا المشروع من المعاهد الوطنية للصحة منح EY025290، GM127652، وجامعة روتشستر بدء التمويل.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
