Expressão e purificação dos canais de íon Bestrophin mamíferos
Summary
A purificação dos canais iônicos é muitas vezes um desafio, mas uma vez alcançado, pode potencialmente permitir investigações em vitro das funções e estruturas dos canais. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo para a expressão e purificação de proteínas de mamíferos bestrophin, uma família de Ca2 +-ativado canais Cl– .
Abstract
O genoma humano codifica quatro paralogs de bestrophin, nomeadamente BEST1, BEST2, BEST3 e BEST4. BEST1, codificada pelo gene BEST1 , é um Ca2 +-ativado Cl– canal (CaCC) predominantemente expressado no epitélio pigmentar da retina (RPE). O significado fisiológico e patológico de BEST1 é realçado pelo fato de que mais de 200 mutações diferentes no gene BEST1 foram geneticamente ligadas a um espectro de pelo menos cinco doenças degenerativas da retina, como a melhor vitelliform Distrofia macular (doença melhor). Portanto, compreendendo a biofísica dos canais bestrophin no nível do único-molécula tem enorme significado. No entanto, obtenção de canais iônicos de mamíferos purificada é muitas vezes uma tarefa desafiadora. Aqui, nós relatamos um protocolo para a expressão de proteínas de mamíferos bestrophin com o sistema de transferência do gene de baculovirus BacMam e sua purificação por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. As proteínas purified têm o potencial para ser utilizado em posteriores análises funcionais e estruturais, tais como gravação eletrofisiológica no bilayers do lipid e Cristalografia. Importante, este gasoduto pode ser adaptado para estudar as funções e estruturas de outros canais iônicos.
Introduction
Bestrophins é uma família de canais iônicos conservada através da espécie, variando de bactérias a seres humanos1. Em humanos, o gene BEST1 , localizado no cromossoma 11q12.3, codifica a proteína de membrana Bestrophin-1 (BEST1) que se expressa predominantemente na membrana basolateral das células do epitélio (RPE) pigmento da retina dos olhos2,3 ,4. Composto de 585 aminoácidos, o primeiro ~ 350 dos quais são altamente conservadas entre as espécies e conter sua região transmembrana, BEST1 atua como um CaCC em seres humanos1,5,6. Além disso, os BEST1 homologs em galinhas Klebsiella pneumoniae ambos funcionam como homopentamers7,8, sugerindo um alto nível de conservação ao longo da evolução.
Nos seres humanos, mais de 200 mutações no gene BEST1 clinicamente têm sido associadas a um grupo de doenças de degeneração da retina chamado bestrophinopathies1,9. Cinco bestrophinopathies específicos têm sido relatados, incluindo doença melhor, distrofia vitelliform adulto-início, autossômica dominante vitreoretinochoroidopathy, autossômica recessiva bestrophinopathy e retinite pigmentosa3,4 ,10,11,12,13,14. Estas doenças, que levam a diminuição da acuidade visual e até mesmo cegueira, são atualmente incurável. A fim de desenvolver tratamentos terapêuticos e medicina potencialmente personalizada, é de fundamental importância compreender como essas mutações causam doenças de BEST1 influenciam a função e a estrutura do BEST1 canal15. Para estes fins, os pesquisadores precisam obter canais bestrophin purificado (tipo selvagem e/ou mutante) e conduta em vitro análises5,8.
O primeiro passo fundamental é a expressão de canais de bestrophin de espécies superiores em células de mamíferos. Como transdução de baculovirus de células HEK293-F (sistema BacMam) é um método poderoso para heterologously express de16,de proteínas de membrana17, este protocolo utiliza um vetor de BacMam (pEG BacMam) otimizado para expressão robusta do alvo da proteína18, que neste caso é um homólogo de mamíferos bestrophin. Este vetor tem sido usado para a expressão de várias proteínas de membrana, incluindo G-receptores, receptores nucleares e outros canais de íon18. Há também evidências de que as proteínas produzidas são apropriadas para cristalografia18. Com altos níveis de expressão em células HEK293-F, as proteínas podem então ser purificadas usando cromatografia; especificamente, no caso de bestrophins, tanto a afinidade e a cromatografia de exclusão de tamanho podem ser usados.
Uma vez que este protocolo é aperfeiçoá-lo para um canal de bestrophin, a proteína purificada pode ser analisada para sua função e estrutura através da bicamada lipídica planar e cristalografia de raios x, respectivamente,5,8. No total, essas técnicas fornecem um poderoso pipeline para investigações funcionais e estruturais de bestrophins e outros canais de íon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um pipeline útil para expressão e purificação dos canais de íon bestrophin mamíferos deve ser usado para análises futuras em vitro . Enquanto o dispositivo FPLC é necessário para a cromatografia de exclusão de tamanho, uma bomba de seringa é suficiente para todas as etapas da cromatografia de afinidade, incluindo vinculação, lavagem e eluição. Ao usar uma bomba de seringa para soluções de impulso (em uma seringa) através de uma coluna, é essencial a subjacência de lado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto foi financiado pelo NIH subsídios EY025290, GM127652 e da Universidade de Rochester financiamento de start-up.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
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