Summary

Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin

Published: August 02, 2018
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Summary

La purificación de los canales iónicos es a menudo difícil, pero una vez alcanzado, pueden permitir en vitro las investigaciones de las funciones y estructuras de los canales. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso para la expresión y purificación de proteínas de mamíferos bestrophin, una familia de Ca2 +-activa los canales de Cl .

Abstract

El genoma codifica cuatro paralogs de bestrophin, es decir, BEST1, BEST2, BEST3 y BEST4. BEST1, codificada por el gen BEST1 , es un Ca2 +-activa Cl canal (CaCC) predominante expresado en epitelio retiniano del pigmento (RPE). La importancia fisiológica y patológica de BEST1 destaca por el hecho de que más de 200 mutaciones distintas en el gen BEST1 se han relacionado genéticamente con un espectro de por lo menos cinco trastornos degenerativos retinianos, como vitelliform mejor distrofia macular (enfermedad de Best). Por lo tanto, comprensión de la biofísica de canales de bestrophin a nivel de una sola molécula tiene gran importancia. Sin embargo, obtención de canales iónicos mamíferos purificada es a menudo una tarea difícil. Aquí, Divulgamos un protocolo para la expresión de proteínas de mamíferos bestrophin con el sistema de transferencia de genes de BacMam baculovirus y su purificación por afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. Las proteínas purificadas tienen el potencial para ser utilizados en posteriores análisis funcionales y estructurales, como la grabación electrofisiológica en bicapas lipídicas soportadas y Cristalografía. Lo importante, esta tubería puede ser adaptada para el estudio de las funciones y estructuras de otros canales iónicos.

Introduction

Bestrophins son una familia de canales iónicos, conservada a través de especies diferentes de bacterias a los seres humanos1. En los seres humanos, el gene BEST1 , situado en el cromosoma 11q12.3, codifica la proteína de membrana Bestrophin-1 (BEST1) que se expresa predominantemente en la membrana basolateral de las células del epitelio (RPE) pigmentario de la retina de los ojos2,3 ,4. Compuesta por 585 aminoácidos, el primer ~ 350 de los cuales están muy conservadas entre especies y contienen su región transmembrana, BEST1 actúa como un CaCC en los seres humanos1,5,6. Además, los homólogos BEST1 en pollos y Klebsiella pneumoniae funcionan como homopentamers7,8, lo que sugiere un alto nivel de conservación a lo largo de la evolución.

En los seres humanos, más de 200 mutaciones en el gen BEST1 han sido clínicamente asociadas a un grupo de enfermedades de degeneración retiniana llamado bestrophinopathies1,9. Cinco bestrophinopathies específicas se han divulgado, incluyendo enfermedad mejor, vitelliform adulto distrofia, autosómica dominante vitreoretinochoroidopathy, bestrophinopathy recesivo autosomal y pigmentosa de la retinitis3,4 ,10,11,12,13,14. Estas enfermedades, que conducen a la disminución de la visión e incluso ceguera, son actualmente intratables. Con el fin de desarrollar tratamientos terapéuticos y medicina personalizada potencialmente, es fundamental para entender cómo estas mutaciones enfermedad-que causan BEST1 influyen en la función y la estructura del BEST1 canal15. A estos efectos, los investigadores deben obtener canales de bestrophin purificada (tipo salvaje y mutante) y llevar a cabo in vitro análisis5,8.

El primer paso clave es la expresión de canales de bestrophin de especies mayores en células de mamíferos. Como baculovirus transduction de las células HEK293-F (el sistema de BacMam) es un método poderoso para expresar heterologously membrana proteínas16,17, este protocolo utiliza un vector de BacMam optimizado (pEG BacMam) para la expresión robusta de la objetivo proteína18, que en este caso es un homólogo de mamífero bestrophin. Este vector se ha utilizado para la expresión de diversas proteínas de membrana, incluyendo receptores g-proteína-juntados, receptores nucleares y otros canales de iones18. También hay evidencia de que las proteínas producidas son convenientes para Cristalografía18. Con altos niveles de expresión en células HEK293-F, las proteínas se pueden entonces purificar mediante cromatografía; específicamente, en el caso de bestrophins, afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño pueden utilizarse.

Una vez que este protocolo está optimizado para un canal de bestrophin, la proteína purificada puede entonces analizarse por su función y estructura a través de la bicapa lipídica planar y Cristalografía de rayos x, respectivamente de5,8. En conjunto, estas técnicas proporcionan una tubería de gran alcance para las investigaciones funcionales y estructurales de bestrophins y otros canales de iones.

Protocol

1. producción de BacMam expresión baculovirus La secuencia de codificación de una proteína deseada bestrophin mamíferos Inserte la clavija BacMam vector18 con una secuencia de reconocimiento de proteasa tabaco Etch Virus (TEV), seguida por un GFP-10 x su etiqueta en el c-término de la proteína. Transfectar transitoriamente el plásmido de expresión en adhesivo HEK293 células19,20,21…

Representative Results

La intensidad de fluorescencia en transitorio transfected las células HEK293 adhesivo (figura 1A) es un buen indicador para el nivel de expresión de la proteína proyectada en células HEK293-F de suspensión (figura 1B). Si la proteína diana no se expresa bien o mal se encuentra localizada en las células HEK293 después de transfección transitoria, se recomienda considerar modificar la construcción de la expresión (po…

Discussion

Este protocolo describe un oleoducto útil para la expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos bestrophin a utilizarse para el análisis futuro de vitro . Mientras que el dispositivo FPLC es necesario para la cromatografía por exclusión de tamaño, una bomba de jeringa es suficiente para todos los pasos de cromatografía de afinidad como vinculante, lavado y liberador. Cuando se utiliza una bomba de jeringa para soluciones de push (en jeringa) a través de una columna, es esencial para el …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH EY025290 y GM127652 de la Universidad de Rochester financiación de puesta en marcha.

Materials

HEPES Fisher Scientific AC327265000 
NaCl Fisher Scientific AC446212500
Glycerol Fisher Scientific G33-500
Imidazole Fisher Scientific AC301870010
MgCl2 Fisher Scientific AC197530010 
TCEP Fisher Scientific AA4058704 
Aprotinin Fisher Scientific AAJ63039MA
Leupeptin Fisher Scientific AAJ61188MB 
Pepstatin A Fisher Scientific AAJ20037MB
Phenylmethylsulfonyl fluoride Fisher Scientific AC215740050
DDM sol-grade Anatrace D310S
DDM anagrade Anatrace D310
Sf-900 II SFM ThermoFisher 10902179
FreeStyle medium ThermoFisher 12338018
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
High pressure homogenizer Avestin Emulsiflex-C5
HisTrap column GE 17-5248-01
Superdex-200 column GE 28990944
AKTA Pure GE 29018224
Ultra-15 centrifugal filter units Millipore UFC910024
Ultra-4 centrifugal filter units Millipore UFC810024
Ultra-0.5 centrifugal filter units Millipore UFC505024
Optima XE-90 Ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Mini-PROTEAN Tetra Cell Bio-Rad 1658004
Mini-PROTEAN precast gel Bio-Rad 4561084
T100 Thermal Cycler Bio-Rad 1861096
PolyJet transfection reagent SignaGen SL100688
pEG BacMam vector Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute

References

  1. Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
  2. Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
  3. Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
  4. Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
  5. Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
  6. Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
  7. Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
  8. Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
  9. Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
  10. Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
  11. Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
  12. Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
  13. Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
  14. Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
  15. Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
  16. Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
  17. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  18. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  19. Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
  20. Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
  21. Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
  22. Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
  23. Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
  24. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  25. Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
  26. Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).

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Cite This Article
Kittredge, A., Ward, N., Hopiavuori, A., Zhang , Y., Yang, T. Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels. J. Vis. Exp. (138), e57832, doi:10.3791/57832 (2018).

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