Выражение и очистки от млекопитающих Bestrophin ионных каналов
Summary
Очистки ионных каналов часто является сложной, но как только достигнуто, он потенциально может позволить в vitro исследования функций и структуры каналов. Здесь мы описываем ступенчатой процедуры для выражения и очистки белков млекопитающих bestrophin, семейство Ca2 +-активированный Cl– каналы.
Abstract
Человеческий геном кодирует четыре bestrophin паралоги, а именно: BEST1, BEST2, BEST3 и BEST4. BEST1, кодируемых геном BEST1 , является Ca2 +-активированный Cl– канал (CaCC) преимущественно выражена в пигментный эпителий сетчатки (ПЭС). Физиологические и патологические значение BEST1 выделяется тот факт, что более 200 различных мутаций в гене BEST1 были генетически связаны с спектр по меньшей мере пять сетчатки дегенеративных расстройств, таких как лучший Вителлиформная макулярная дистрофия (лучший болезнь). Таким образом понимание биофизики bestrophin каналов на уровне одного молекула имеет огромное значение. Однако получение очищенной млекопитающих ионные каналы часто является сложной задачей. Здесь мы приводим протокол для выражения млекопитающих bestrophin белков с системой передачи BacMam бакуловирусы генов и их очищение сродства и размер-гель-проникающей хроматографии. Очищенные протеины имеют потенциал, чтобы быть использованы в последующих функционального и структурного анализа, например электрофизиологических запись в липидных бислоев и кристаллография. Важно отметить, что этот трубопровод может быть адаптирована для изучения функций и структур других ионных каналов.
Introduction
Bestrophins — семейство ионных каналов сохраняется через видов, изменяясь от бактерий до человека1. В организме человека ген BEST1 , расположенный на хромосоме 11q12.3, кодирует мембранный белок Bestrophin-1 (BEST1), которая выражается главным образом в базолатеральной мембраны клеток сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) глаза2,3 ,4. Состоит из 585 аминокислот, первый ~ 350 из которых сохраняются высоко среди видов и содержат трансмембранного регионе, BEST1 действует как CaCC людей1,5,6. Кроме того гомолог BEST1 в кур и Klebsiella pneumoniae функционировать в качестве homopentamers7,8, предлагая высокий уровень сохранения всей эволюции.
В организме человека свыше 200 мутаций в гене BEST1 были клинически связаны к группе заболеваний дегенерация сетчатки, под названием bestrophinopathies1,9. Были зарегистрированы пять конкретных bestrophinopathies, включая лучший болезни взрослого начала Вителлиформная дистрофия, аутосомно-доминирующим vitreoretinochoroidopathy, аутосомно-рецессивный bestrophinopathy и пигментный ретинит3,4 ,10,11,12,,1314. Эти заболевания, которые приводят к снижению зрения и даже слепоты, в настоящее время неизлечимыми. Для того, чтобы разработать терапевтические процедуры и потенциально персонализированной медицины, важно, чтобы понять, как эти болезнетворные мутации BEST1 влияние на функции и структура BEST1 канал15. Для этих целей исследователи должны получить очищенный bestrophin (дикого типа и мутантов) каналов и поведения в экстракорпорального анализы5,8.
Первым ключевым шагом является выражением bestrophin каналов из высших видов в mammalian клетках. Трансдукция бакуловирусы клеток HEK293-F (BacMam система) является мощным методом выразить участием мембранных белков16,17, этот протокол использует оптимизированные BacMam вектор (pEG BacMam) для надежной выражение целевых белков18, который в данном случае является млекопитающих bestrophin гомолога. Этот вектор был использован для выражения различных мембранных белков, в том числе G-белок-рецепторы, ядерные рецепторы и другие каналы иона18. Есть также доказательства того, что произведенные белки подходят для кристаллографии18. С высоким уровнем экспрессии в HEK293-F клеток белков могут затем быть очищены с помощью хроматографии; в частности в случае bestrophins, можно использовать как сходства, так и размер-гель-проникающей хроматографии.
После того, как этот протокол доработаны для канала bestrophin, очищенный протеин после этого могут быть проанализированы для его функции и структуры через плоские липидного бислоя и рентгеноструктурного анализа, соответственно5,8. Вообще эти методы предоставляют мощный трубопровода для функциональных и структурных исследований bestrophins и других ионных каналов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает полезным трубопровода для очистки каналов иона млекопитающих bestrophin использоваться для будущего в vitro анализов и выражения. Хотя ПСОК устройства требуется для размера-гель-проникающей хроматографии, шприцевый насос является достаточным для всех шагов афф?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект финансировался NIH грантов EY025290, GM127652 и Университет Рочестер начального финансирования.
Materials
| HEPES | Fisher Scientific | AC327265000 | |
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific | AA4058704 | |
| Aprotinin | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptin | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatin A | Fisher Scientific | AAJ20037MB | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| DDM sol-grade | Anatrace | D310S | |
| DDM anagrade | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medium | ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | |
| High pressure homogenizer | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| HisTrap column | GE | 17-5248-01 | |
| Superdex-200 column | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 centrifugal filter units | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 centrifugal filter units | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 centrifugal filter units | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Mini-PROTEAN precast gel | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| PolyJet transfection reagent | SignaGen | SL100688 | |
| pEG BacMam vector | Obtained from the Gouaux lab at Vollum Institute |
References
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Human Molecular Genetics. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nature Genetics. 19 (3), 241-247 (1998).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. eLife. 6, (2017).
- Tsunenari, T., et al. Structure-function analysis of the bestrophin family of anion channels. Journal of Biological Chemistry. 278 (42), 41114-41125 (2003).
- Kane Dickson, V., Pedi, L., Long, S. B. Structure and insights into the function of a Ca(2+)-activated Cl(-) channel. Nature. 516 (7530), 213-218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Johnson, A. A., et al. Bestrophin 1 and retinal disease. Progress in Retinal and Eye Research. , (2017).
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Human Genetics. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. American Journal of Human Genetics. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. American Journal of Human Genetics. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. European Journal of Human Genetics. 8 (4), 286-292 (2000).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Molecular Therapy. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nature Communications. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. Public Library of Science One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nature Chemical Biology. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. Journal of Physiology. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Schmidt, C., Urlaub, H. Combining cryo-electron microscopy (cryo-EM) and cross-linking mass spectrometry (CX-MS) for structural elucidation of large protein assemblies. Currents Opinions in Structural Biology. 46, 157-168 (2017).
- Sun, W., Zheng, W., Simeonov, A. Drug discovery and development for rare genetic disorders. American Journal of Medical Genetics Part A. 173 (9), 2307-2322 (2017).
