قياس الألوان فحوصات من داخل الخلايا لاكتات الصغيرة وبيروفات في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس
Summary
يصف لنا استخراج معدلة على نطاق ضيق وفحوصات اللونية لاكتات وبيروفات في ديدان أسطوانية C. ايليجانس. عند استخدام أدوات التحليل التجاري، المهم التطور التقني الحساسية والدقة. ترسيب البروتين في استخراج هي الخطوة الأكثر أهمية لتحديد الكمية من نواتج الأيض داخل الخلايا.
Abstract
لاكتات وبيروفات وسيطة رئيسية للطاقة داخل الخلايا الأيضية. رصد نسبة لاكتات/بيروفات في الخلايا يساعد على تحديد ما إذا كان هناك اختلال في الأيض الطاقة المرتبطة بالسن بين المتقدرية الفسفرة وتحلل الهوائية. هنا، علينا أن نبدي الاستفادة مجموعات تجارية مقايسة اللونية لاكتات وبيروفات في نموذج الكائن الحي C. ايليجانس. في الآونة الأخيرة، بحساسية ودقة من أطقم مقايسة اللونية/فلوريميتريك قد تحسنت إلى حد كبير بالبحث والتطوير التي تقوم بها الشركات المصنعة للكاشف. ومكنت الكواشف تحسين استخدام فحوصات صغيرة الحجم مع لوحة 96-جيدا في C. ايليجانس. بشكل عام، الإنزيم فلوريميتريك متفوقة في مجال التوعية مقايسة اللونية؛ ومع ذلك، نهج قياس الألوان أكثر مناسبة للاستخدام في المختبرات المشتركة. مسألة هامة أخرى في هذه الاختبارات لتحديد الكمية ترسيب البروتين المتجانس C. ايليجانس العينات. في أسلوبنا ترسيب البروتين، بريسيبيتانتس مشتركة (مثلاً.، حمض التريكلوروسيتيك، وحمض بيرتشلوريك وحمض ميتافوسفوريك) وتستخدم لإعداد نموذج. بإضافة مباشرة مرسب الباردة (تركيز النهائي 5%) خلال التجانس بإعداد عينة فحص خالية من البروتين.
Introduction
تركيزات لاكتات وبيروفات تعتبر على نطاق واسع كوسيطة استقلاب الطاقة، وهي تتصل بالدول من تحلل، ودورة حمض تريكاربوكسيليتش (TCA)، وسلسلة نقل الإلكترون في خلايا الكائنات الحية الهوائية. سلسلة من ردود الفعل في تحلل أكسدة الجلوكوز إلى بيروفات، التي تقع في مفترق طرق الأيض ويمكن تحويلها إلى الكربوهيدرات عن طريق جلوكونيوجينيسيس، الأحماض الدهنية والايض الطاقة عن طريق البيروفات، والأنين من الأحماض الأمينية. دورة TCA يحدث تحت وجود الأوكسجين الذائب كافية، وهو أمر أساسي لتحويل الجلوكوز إلى طاقة. خاصة، هو تغيير الأيض الثانوية ظاهرة مثيرة لاهتمام التي تحلل يستخدم أساسا لإنتاج الطاقة والتنفس المتقدرية الهوائية، والذي يتضمن بدوره TCA وسلسلة نقل الإلكترون، دوونريجولاتيد في الثدييات سرطان الخلايا1،2. وأظهرت لنا مؤخرا أن مستويات اللاكتات ونسبة ما يترتب عليها من لاكتات/بيروفات (L/P) انخفض خلال الشيخوخة في الكائن الحي النموذجي ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس). وبالمثل، وجدنا أن القامع الورم الثدييات أورثولوج p53 المجلس الانتخابي المؤقت-1 في C. ايليجانس دوراً هاما في التعديلات المتعلقة بالسن في استقلاب الطاقة من خلال تفعيل أهداف النسخي3.
في فحوصات بيولوجية، مثل قياس تركيزات لاكتات وبيروفات في الخلايا، والحساسية، ودقة وحجم العينة، ووقت الحضانة لمجموعات مقايسة اللونية/فلوريميتريك قد تحسنت جذريا. ونظرا للابتكارات التكنولوجية، ونحن الآن قادرة على تحليل مختلف نواتج الأيض ونواتج الأيض الوسيطة دون ثقافة واسعة النطاق من C. ايليجانس، هو أمر صعب نظراً لصغر حجمه. وبصفة عامة، حساسية مقايسة اللونية أمر من حجم أصغر من أن الإنزيم فلوريميتريك؛ بيد أن النهج اللونية أكثر ملاءمة في الإعداد لمختبرات مشتركة. وعلاوة على ذلك، أسلوب استخراج تتضمن ترسيب البروتين وتجانس حاسمة لتحديد كمية تركيزات لاكتات وبيروفات في الخلايا C. ايليجانس نظراً لديدان أسطوانية هذا مضمن في الهيكل الخارجي ودعا بشرة، خلافا لخلايا الثدييات خطوط4،5. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تحليل تركيزات لاكتات وبيروفات باستخدام مجموعات مقايسة اللونية التجارية بما في ذلك النصائح لاستخراج عينة من C. ايليجانس.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند استخدام هذه المجموعات اللونية المقايسة، الخطوة الأكثر أهمية في استخراج عينة للكشف عن لاكتات الخلوية وبيروفات بدقة في C. ايليجانس هي عملية ترسيب البروتين خلال التجانس (الشكل 1). ليس من الضرورة القصوى لاستخدام الخالطون تفلون، كسائر أجهزة المجانسة (مثلاً.، دونس ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل ماليا “منحة بحثية خاصة” من ديتو بونكا جامعة إلى ياناسي سومينو.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
