小規模な比色試金の細胞内乳酸と線虫の線虫のピルビン酸
Summary
変更された小規模な抽出と乳酸と線虫のピルビン酸の比色定量法について述べる線虫。商業アッセイ キットを利用するときの感度と精度の技術の開発が重要です。抽出の蛋白質の沈殿物は、細胞内の代謝物の定量法の最も重要なステップです。
Abstract
乳酸とピルビン酸は、細胞内のエネルギー代謝の鍵中間体です。細胞における乳酸/ピルビン酸比の変化は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化と好気性解糖作用の間の加齢に伴うエネルギー代謝に不均衡があるかどうかを判断するのに役立ちます。ここでは、線虫モデル有機体の乳酸とピルビン酸の商業の比色アッセイ キットの使用率を表示します。最近、感度と比色/蛍光アッセイ キットの精度が大幅に改善されました研究試薬メーカーによる開発によって。改良された試薬は、線虫の 96 ウェル プレートでの小規模な試金の使用を有効にしています。一般的に、蛍光アッセイは感度よりも優れて比色試金;ただし、比色定量のアプローチは一般的な研究室での使用に適した。定量のためのこれらの試金のもう一つの重要な問題は、均質化のc. の elegansの蛋白質の沈殿物のサンプル。私たちのタンパク質の沈殿法、一般的な沈殿の (e.g。、トリクロロ酢酸、過塩素酸およびメタリン酸) サンプル調製に使用。無料の蛋白質の試金のサンプルは、均質化の中に直接冷たい鉛塩法 (最終濃度 5%) を追加することによって準備されます。
Introduction
乳酸とピルビン酸の濃度は、エネルギー代謝の中間体として広くみなされ、解糖作用、トリカルボン酸 (TCA) サイクル、および好気性生物の細胞における電子輸送チェーンの状態に関連しています。一連の解糖系の反応は、グルコース代謝の岐路にあると糖新生、脂肪酸、アセチル coa、を介してエネルギー代謝を炭水化物とアミノ酸のアラニンに変換できるピルビン酸に酸化します。TCA サイクルは、糖のエネルギーへの変換のために基本的十分な溶存酸素の存在下で発生します。特に、二次代謝の変化は、エネルギー生産のため主に解糖系が使用されている興味深い現象と TCA サイクルと電子輸送鎖を含む、好気性のミトコンドリア呼吸はダウンレギュ レート哺乳類の癌細胞の1,2を実行します。我々 は最近モデル有機体線虫(C. elegans) の時効中における血中乳酸値とそれに伴う乳酸/ピルビン酸 (L/P) 比が減少したことを示した。同様に、 c. の elegansの哺乳類腫瘍のサプレッサー p53 オーソログ CEP 1 では、その転写制御ターゲット3の活性化を介してエネルギー代謝の加齢に伴う変化の重要な役割がわかった。
細胞の乳酸とピルビン酸濃度の測定などの生物学的アッセイでは、感度、精度、サンプル サイズ、および比色/蛍光アッセイ キットのインキュベーション時間が劇的に改善されています。技術革新のおかげで、我々 はその小さなサイズを与えられた困難であるさまざまな代謝産物や線虫の大規模な文化なし中間代謝物を分析することができるされます。一般に、比色定量法の感度は蛍光アッセイ; より小さい大きさの順序ただし、比色方法は、一般的な実験室の設定でより適しています。この線虫が外骨格に囲まれているのでさらに、均質化および蛋白質の沈殿物を含む抽出法は線虫の細胞に乳酸とピルビン酸濃度の定量のために重要哺乳類培養細胞ライン4、5とは異なり、キューティクルと呼ばれます。ここでは、線虫からサンプル抽出のためのヒントを含む商業比色アッセイ キットを使用して乳酸とピルビン酸の濃度を分析するプロトコルについて述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
これらの比色アッセイ キットを利用して、細胞の乳酸を検出するサンプル抽出の最も重要なステップと正確にc. の elegansのピルビン酸は均質化 (図 1) の間に蛋白質の沈殿物の処理にです。厳密に他ホモジナイザーとしてテフロン ホモジナイザーを使用する必要はありません (e.g。、Dounce 組織グラインダー、またはビード ミルズをテーパーと) ワームの小規…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、角野ヤナセに大東文化大学から特別研究助成によって支えられた財政的に。
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
