ערכי צבע מוחלטים מבחני של תאיים לקטט בקנה מידה קטן ו פירובט ב נמטודות Caenorhabditis elegans
Summary
נתאר החילוץ בקנה מידה קטן שונה ואת מבחני ערכי צבע מוחלטים של ו לקטט פירובט ב תולעים נימיות C. elegans. כאשר ניצול מסחרי assay ערכות, פיתוח טכני של הרגישות והדיוק שלהם חשובה. חלבון משקעים החילוץ הוא השלב הקריטי ביותר של הקביעה כמותית של מטבוליטים תאיים.
Abstract
לקטט פירובט intermediates מפתח של מסלולים מטבוליים אנרגיה תאיים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. פיקוח על היחס לקטאט/פירובט בתאים מסייעת כדי לקבוע אם קיים חוסר איזון בחילוף החומרים האנרגיה הקשורות לגיל בין זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי גליקוליזה אירובי. כאן, אנו מראים את הניצול של ערכות assay ערכי צבע מוחלטים מסחרי ו לקטט פירובט באורגניזם מודל C. elegans. לאחרונה, הרגישות והדיוק של ערכות ערכי צבע מוחלטים/fluorimetric assay שופרו במידה רבה על ידי מחקר ופיתוח בניצוחו של ריאגנט יצרנים. ריאגנטים משופרת אפשרו את השימוש מבחני בקנה מידה קטן עם צלחת 96-ובכן C. elegans. באופן כללי, וזמינותו fluorimetric עדיפה על רגישות וזמינותו ערכי צבע מוחלטים; עם זאת, הגישה ערכי צבע מוחלטים מתאים יותר לשימוש במעבדות נפוצות. בעיה חשובה נוספת ב אלה מבחני לקביעת כמותית היא חלבון משקעים של הומוגני C. elegans דגימות. בשיטה שלנו חלבון משקעים, precipitants משותף (למשל., חומצת חומץ טריכלור, חומצה על-כלורית, חומצה metaphosphoric) משמשים עבור הכנת הדוגמא. מדגם assay נטול חלבון מוגש על-ידי הוספת ישירות קר precipitant (ריכוז הסופי של 5%) במהלך המגון.
Introduction
ריכוז ו לקטט פירובט נחשבים נרחב intermediates של חילוף החומרים האנרגיה, קשורים לארצות הברית גליקוליזה, חומצה tricarboxylic (TCA) מחזור ו תחבורה אלקטרונים בשרשרת בתאים של אורגניזמים אירוביים. סדרה של תגובות בגליקוליזה נישחק גלוקוז כדי פירובט, אשר שוכנת בצומת דרכים מטבולית, ניתן להמיר פחמימות באמצעות גלוקונאוגנזה, חומצות שומן, חילוף החומרים האנרגיה באמצעות אצטיל קואנזים a, את אלנין חומצה אמינית. מחזור TCA מתרחשת תחת הנוכחות של מספיק חמצן מומס, והוא היסוד עבור ההמרה של גלוקוז לאנרגיה. במיוחד, משינוי של חילוף חומרים משני הוא תופעה מעניינת שבה גליקוליזה משמשת בעיקר לייצור אנרגיה והוא אירובי נשימה מיטוכונדריאלי, אשר מערבת את מחזור TCA ושרשרת אלקטרון תחבורה, downregulated סרטן בתרבית של תאי1,2. הראנו לאחרונה את רמת חומצת החלב ואת היחס הסוגר לקטאט/פירובט (L/P) ירד במהלך ההזדקנות באורגניזם מודל Caenorhabditis elegans (C. elegans). כמו כן, מצאנו כי גידול בתרבית של משתיק קול p53 ortholog CEP-1 C . elegans יש תפקיד חשוב בהתיקונים הקשורות לגיל של חילוף החומרים האנרגיה דרך ההפעלה של מטרות תעתיק3.
במבחני ביולוגיים, כגון מדידת ריכוזים ו לקטט פירובט בתאים, הרגישות דיוק, גודל המדגם, זמן הדגירה של ערכי צבע מוחלטים/fluorimetric assay ערכות שופרו באופן דרמטי. בשל חידושים טכנולוגיים, עתה אנו מסוגלים לנתח מטבוליטים שונים של מטבוליטים ביניים ללא תרבות בקנה מידה גדול של C. elegans, אשר קשה בהתחשב גודלו הקטן. באופן כללי, הרגישות של וזמינותו ערכי צבע מוחלטים היא בסדר גודל קטן יותר מזה של וזמינותו fluorimetric; עם זאת, הגישה ערכי צבע מוחלטים מתאימה יותר בסביבה של מעבדות נפוצות. יתר על כן, שיטת החילוץ המכילה משקעים המגון וחלבון הוא קריטי עבור קביעת כמותית של ריכוזים ו לקטט פירובט בתאי C. elegans כי תחום זה תולעים נימיות שלד חיצוני קרא את הקוטיקולה, בניגוד בתרבית של תאים בתרבית קווים4,5. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לנתח ריכוזים ו לקטט פירובט באמצעות ערכות assay ערכי צבע מוחלטים מסחרי הכולל טיפים להפקת מדגם של C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאשר ניצול ערכות אלה assay ערכי צבע מוחלטים, השלב הקריטי ביותר מדגם החילוץ כדי לזהות לקטט הסלולר ו פירובט במדויק ב- C. elegans הוא התהליך של חלבון המדידות המגון (איור 1). . זה לא הכרחי כדי להשתמש מהמגן טפלון, כמו אחרים לטקס (למשל., דאונס, צמצום מטחנות רקמות או חרוז מילס) מתאימ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מבחינה כלכלית נתמך על ידי מענק מחקר מיוחד מאוניברסיטת Bunka Daito אל Sumino Yanase.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
