Мелких колориметрические Assays внутриклеточных лактата и пирувата в нематоды Caenorhabditis elegans
Summary
Мы описываем изменение мелкомасштабной добычи и колориметрические анализов лактата и пирувата в нематода C. elegans. При использовании коммерческих пробирного наборы, техническое развитие их чувствительность и точность имеет важное значение. Осадков белок в добыче является наиболее важным этапом для количественного определения внутриклеточных метаболитов.
Abstract
Лактата и пирувата являются ключевыми интермедиатов внутриклеточных энергии метаболических. Мониторинг соотношения молочной кислоты/пирувата в клетках помогает определить, является ли есть дисбаланс в метаболизме энергии, связанных с возрастом между митохондриальной окислительного фосфорилирования и аэробного гликолиза. Здесь мы покажем использование коммерческих колориметрического анализа комплектов для лактата и пирувата в организме модель C. elegans. Недавно чувствительность и точность колориметрии/Флуориметрическое пробирного наборы были значительно улучшилось, научных исследований и разработок, проводимых производителями реагента. Улучшенная реагентов позволили использование мелких анализов с 96-луночных пластины в C. elegans. В общем Флуориметрическое пробирного превосходит в чувствительности колориметрического анализа; Однако колориметрические подход больше подходит для использования в общих лабораториях. Еще одним важным вопросом в этих анализов для количественного определения является белок осадков гомогенизированные C. elegans образцы. В методе осадков белок, общие выделений (например., трихлоруксусная кислота, хлорной кислоты и metaphosphoric кислоты) используются для пробоподготовки. Бесплатно белка пробирного образец готовится непосредственно добавив холодной осадителя (конечной концентрации 5%), во время гомогенизации.
Introduction
Концентрации лактата и пирувата широко рассматривается как промежуточные энергии метаболизма и связаны в Штаты гликолиза, цикла трикарбоновой кислоты (TCA) и электрон-транспортной цепи в клетках аэробных организмов. Серию реакций в гликолизе окисления глюкозы пируват, который находится на перепутье метаболических и могут быть преобразованы для углеводов через глюконеогенез, жирных кислот и метаболизм энергии через ацетил-КоА и аминокислота аланин. TCA цикл происходит при наличии достаточного количества растворенного кислорода и является основополагающим для преобразования глюкозы энергии. Особенно изменение вторичного метаболизма является интересным феноменом, в котором гликолиз используется преимущественно для производства энергии и аэробных митохондриальное дыхание, который включает цикл ТСА и электрон-транспортной цепи, downregulated в млекопитающих рака клеток в1,2. Недавно мы показали, что уровень лактата и последующее лактата в пирувата (L/P) соотношение уменьшилось во время старения в организме модель Caenorhabditis elegans (C. elegans). Аналогичным образом мы обнаружили, что млекопитающих опухоли ortholog подавитель p53 ВИС-1 в C. elegans имеет важную роль в возрастных изменений метаболизма энергии путем активации его транскрипционный анализ цели3.
В биологических анализов, например измерения концентрации лактата и пирувата в клетках чувствительность, точность, размер выборки и время инкубации колориметрии/Флуориметрическое пробирного комплектов были улучшены резко. Благодаря технологическим новшествам теперь мы можем анализировать различные метаболиты и промежуточных метаболитов без крупномасштабных культуры C. elegans, который трудно, учитывая ее небольшие размеры. В общем чувствительность колориметрического анализа является на порядок меньше, чем Флуориметрическое анализа; Однако колориметрические подход больше подходит в установлении общих лабораториях. Кроме того метод извлечения, содержащие гомогенизации и белка осадков имеет решающее значение для количественного определения концентраций лактата и пирувата в C. elegans клетки, потому что этот нематода заключена в экзоскелет под названием кутикулы, в отличие от mammalian клетки культивировали линии4,5. Здесь мы описываем протокол для анализа концентрации лактата и пирувата, с помощью коммерческих колориметрического анализа комплектов, включая советы для извлечения образца из C. elegans.
Protocol
Representative Results
Discussion
При использовании этих колориметрических пробирного наборы, наиболее важным этапом в пример извлечения для обнаружения клеточных лактата и пирувата точно в C. elegans является процесс белка осадков во время гомогенизации (рис. 1). Это не строго необходимо использовать …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была финансово поддержана специальный исследовательский грант от Дайто Бунка университета для Сумино Янасэ.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
