Küçük ölçekli Renkölçer deneyleri, intrasellüler laktat ve Pyruvate nematodunun Caenorhabditis elegans içinde
Summary
Değiştirilmiş küçük ölçekli çıkarma ve laktat ve Yuvarlak solucanlar pyruvate Renkölçer deneyleri tarif C. elegans. Ticari tahlil kitleri kullanarak, teknik geliştirme hassasiyet ve doğruluk önemlidir. Ayıklama protein yağış hücre içi metabolitleri kantitatif tayini için en önemli adımdır.
Abstract
Laktat ve pyruvate hücre içi enerji metabolik yollar anahtar ara ürün vardır. Hücrelerdeki laktat/pyruvate oranı izleme yaşa bağlı enerji metabolizması mitokondriyal Oksidatif fosforilasyon ve aerobik glikoliz arasında bir dengesizlik var olup olmadığını belirlemek için yardımcı olur. İşte, model organizma C. elegansticari Renkölçer tahlil kitleri için laktat ve pyruvate kullanımını göstermektedir. Son zamanlarda, duyarlılık ve kolorimetrik/fluorimetric tahlil kitleri doğruluğunu büyük ölçüde araştırma ve geliştirme reaktif üreticileri tarafından yürütülen tarafından geliştirilmiştir. Geliştirilmiş reaktifler C. elegansbir 96-şey plaka ile küçük ölçekli deneyleri kullanımı etkinleştirdiniz. Genel olarak, bir fluorimetric tahlil kolorimetrik bir tahlil için duyarlılık içinde üstündür; Ancak, Renkölçer yaklaşım daha laboratuarında ortak kullanım için uygundur. Başka bir önemli kantitatif tayin için bu deneyleri homojenize C. elegans protein yağış sorundur örnekleri. Bizim protein yağış yöntemindeki ortak precipitants (Örn., trichloroacetic asit, perklorik asit ve metaphosphoric asit) numune hazırlama için kullanılır. Bir tahlil protein ücretsiz örnek doğrudan homojenizasyon sırasında soğuk precipitant (% 5’lik son konsantrasyonu) ekleyerek hazırlanır.
Introduction
Laktat ve pyruvate konsantrasyonları glikoliz, tricarboxylic asit (TCA) ve elektron taşıma zinciri aerobik organizmalar hücrelerdeki Devletleri ile ilgili ve yaygın olarak enerji metabolizmasının ara ürün kabul edilmektedir. Glikoliz reaksiyonları bir dizi okside glikoz pyruvate, metabolik bir kavşakta yatıyor ve karbonhidrat gluconeogenesis, yağ asitleri ve enerji metabolizması acetyl-CoA aracılığıyla aracılığıyla ve amino asit alanin dönüştürülebilir için. TCA döngüsü yeterli çözünmüş oksijen varlığı altında oluşur ve enerji glikoz dönüştürmeye temelini oluşturur. Özellikle, ikincil İLETİMLERİNİZE ilginç bir fenomen glikoliz ağırlıklı olarak enerji üretimi için kullanılır ve TCA döngüsü ve elektron taşıma zinciri içerir, aerobik mitokondrial solunum downregulated memeli kanser hücreleri1,2. Biz son zamanlarda laktat seviyeleri ve bunun sonucunda laktat/pyruvate (L/P) oranı model organizma Caenorhabditis elegans (C. elegans) yaşlanma sırasında azalma gösterdi. Aynı şekilde, bulduk C. elegans içinde memeli tümör baskılayıcı p53 ortholog CEP-1 yaşa bağlı değişiklikler onun transkripsiyon hedefleri3aktivasyonu ile enerji metabolizmasının önemli bir role sahiptir.
Hücreleri, laktat ve pyruvate konsantrasyonlarda ölçümü gibi biyolojik deneyleri, hassasiyet, doğruluk, örnek boyutu ve kolorimetrik/fluorimetric tahlil kitleri kuluçka süresi önemli ölçüde yeniden geliştirilmiştir. Teknolojik yenilikler sayesinde artık zor olan kendi küçük boyutları verilen çeşitli metabolitleri ve ara metabolitleri C. elegans, büyük ölçekli kültür olmadan çözümlenecek edebiliyoruz. Genel olarak, Renkölçer Testin duyarlılığı bir büyüklük fluorimetric tahlil küçük olduğunu; Ancak, Renkölçer yaklaşım daha ortak laboratuvarlar ayarında uygundur. Bu yuvarlak solucanlar bir exoskeleton eklenmiş olduğundan Ayrıca, homojenizasyon ve protein yağış içeren bir ayıklama tekniği C. elegans hücreleri laktat ve pyruvate konsantrasyonlarda kantitatif tayini için çok önemlidir memeli kültürlü hücre hatları4,5aksine kütikül aradı. Burada, laktat ve pyruvate konsantrasyonları C. elegansörnek çıkarılması için ipuçları da dahil olmak üzere ticari Renkölçer tahlil kitleri kullanarak çözümlemek için bir protokol açıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu Renkölçer tahlil kitleri kullanarak zaman hücresel laktat algılamak için örnek çıkarma en kritik adımda ve pyruvate C. elegans içinde doğru homojenizasyon (Şekil 1) sırasında protein yağış işlemidir. Teflon homogenizer, diğer homogenizers kullanmak kesinlikle gerekli değildir (Örn., Dounce ve konik doku öğütücüler veya boncuk fabrikaları) da solucanlar küçük ölçekli çıkarılması uygundur. Biz hücresel laktat ve pyruvate homogenizer pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser mali Sumino Yanase için bir özel araştırma hibe Daito Bunka Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit | BioVision | #K607-100 | colorimetric/fluorimetric 100 assays; Store at -20oC |
| EnzyChrom Pyruvate Assay Kit |
BioAssay Systems |
#EPYR-100 | colorimetric/ fluorometric 100 assays; Store at -20oC |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | colorimetric assay; store at room temperature |
| Trichloroacetic Acid | Wako Pure Chemical | #207-04955 | store at room temperature |
| Teflon homogenizer | Iwaki/Pyrex | #358034 (Wheaton) | Instead of Iwaki/Pyrex, available by Wheaton |
References
- Warburg, O. On the origin of cancer cells. Science. 123, 309-314 (1956).
- Matoba, S., et al. p53 regulates mitochondrial respiration. Science. 312, 1650-1653 (2006).
- Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans. Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , (2007).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Basic culture methods. Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 3-29 (1995).
- Senoo-Matsuda, N., et al. A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).
- Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants. Aging Cell. 12, 130-138 (2013).
- Marbach, E. P., Weil, M. H. Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant. Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).
- Mishur, R. J., et al. Mitochondrial metabolites extend lifespan. Aging Cell. 15, 336-348 (2016).
