Una pantalla de 2 híbrido de levadura en lote para comparar las interacciones proteína

Una comprensión completa de los procesos biológicos de la célula se basa en la búsqueda de las redes de interacción de proteínas que subyacen sus mecanismos moleculares. Un enfoque para identificar las interacciones entre proteínas es la levadura 2-híbrido (Y2H), que trabaja montando un factor de transcripción quimérica de funcionamiento una vez que dos dominios de la proteína de interés unen unos a otros¹. Una típica pantalla de Y2H se realiza mediante la creación de una población de levaduras que alberga tanto una biblioteca de plásmidos que codifican las proteínas interactúan con fusible para un activador transcripcional (ej., proteína de la fusión de presas) y un plásmido determinado ‘cebo’ compuesta por la proteína de interés fusionado a un dominio de unión a ADN (por ejemplo, el dominio de Gal4 DNA-que atan que se une a la secuencia de activación Gal4-upstream). Una de las principales ventajas del enfoque Y2H es que es relativamente fácil y barato para llevar a cabo en un laboratorio típico equipado para trabajo biológico molecular de rutina². Sin embargo, cuando tradicionalmente se realiza, un usuario muestras de colonias individuales que surgen en la selección para una interacción positiva de Y2H. Seriamente, esto limita el número de clones ‘presa’ de biblioteca que puede ser examinado. Este problema se agrava cuando la abundancia de una presa particular de interacción es muy alta en relación con los demás, disminuyendo la posibilidad de detectar la interacción de plásmidos de presas de baja abundancia.

Una solución para usar el principio de Y2H en cobertura del proteoma es el uso de un enfoque con formato de matriz en una matriz que contiene plásmidos conocido presa individual puede ser interrogada digitalmente. Sin embargo, este enfoque requiere una infraestructura que no es fácilmente accesible o rentable a investigadores individuales que estén interesados en definir el interactoma de un pequeño número de proteínas o dominios³. Además, bibliotecas de presa muy complejo que pueden codificar múltiples fragmentos de proteínas interactuantes ampliaría el tamaño de tales matrices matriz tamaño práctico. Una alternativa es realizar ensayos con complejo bibliotecas en lotes y evaluar la presencia de clones interactúan mediante secuenciación masiva en paralelo alto rendimiento⁴. Esto puede aplicarse para analizar la presencia de plásmidos de presas que se presentan en varias colonias con un típico Y2H formato enfoque en cual levadura las células vivienda un par de interacción de proteínas de fusión pueden crecer en una placa de^5,6. Esta idea general se puede acentuarse para aumentar la consulta de ambos múltiples cebo y presa de componentes en el mismo tiempo^7,8.

Sin embargo, muchas investigaciones requieren que un más fácil todavía centra más esfuerzo en pocos proteína ‘cebos’ y pueden beneficiarse más de una consulta exhaustiva y semi-cuantitativa de una sola presa complejo biblioteca. Hemos desarrollado y validado un método para llevar a cabo estudios de interacción de proteínas de gran escala usando un principio Y2H en lote formato⁴. Esto utiliza la tasa de expansión de un plásmido determinado presa como un proxy para la fuerza relativa de Y2H interacción⁹. Profundo secuenciación de los plásmidos dentro de una población sometida a un crecimiento normal o las condiciones de crecimiento selectivo produce un mapa completo de clones que producen interacciones de Y2H fuertes y débiles. El repertorio de interactianos puede ser obtenido y comparado directamente a través de múltiples plásmidos de cebo. El flujo resultante denominado DEEPN (enriquecimiento dinámico para la evaluación de redes de proteínas) así puede utilizarse para identificar interactomes diferencial de las mismas bibliotecas de presa para identificar proteínas, permitiendo la comparación entre una proteína y otra.

Aquí, demostramos DEEPN e introducir mejoras en los métodos de laboratorio que facilitan su uso, que se detallan en la figura 1. Las mejoras significativas incluyen:

Generación de las poblaciones de levadura presas. Uno de los requisitos clave de DEEPN está generando poblaciones de levaduras con cebo diferentes plásmidos que tienen la misma distribución de las bibliotecas de la presa de plásmido. Poblaciones de referencia equivalente de la biblioteca de plásmido de presa son esenciales para hacer comparaciones exactas entre los interactomes de diferentes cebos. Esto se logra mejor cuando un plásmido de biblioteca ya se encuentra en una población de levadura haploide y mover un plásmido determinado cebo en que la población se consigue por el apareamiento para producir un diploide. Aquí, ofrecemos a una guía clara de cómo hacer estas poblaciones usando librerías comerciales ubicados en levadura haploide. Aunque hemos encontrado métodos que generan un alto número de diploides, la eficiencia global de apareamiento de estas cepas de levadura que contiene la biblioteca comercial fue baja. Por lo tanto, construimos una nueva cepa que puede albergar bibliotecas presa que cede más diploides por reacción de acoplamiento.

Nuevo sistema de plásmidos de cebo. Muchos plásmidos actuales que expresan proteínas de la fusión de la ‘carnada’ compuestas de la proteína de interés y un dominio DNA-que atan son 2µ, lo que les permite ampliar su número de copia. Este número de la copia puede ser muy variable en la población y conducir a la variabilidad en la respuesta transcripcional de Y2H. Esto a su vez podría sesgar la capacidad para medir la fuerza de una interacción de proteína determinada basada en la respuesta de crecimiento de células en la selección. Esto puede ser en parte dirección mediante el uso de un plásmido de copia baja, algunos de los cuales se han descrito previamente como el pDEST32 disponible en el mercado¹⁰. Construimos un nuevo plásmido de cebo (pTEF-GBD) que produce proteínas de fusión Gal4-Unión al ADN dominio dentro de un plásmido de copia baja basada en el centrómero de TRP1 portadores del gen de resistencia Kanr que también facilita la clonación de fragmentos de cebo tanto aguas arriba y aguas abajo del dominio de unión al ADN de Gal4.

Biblioteca de fragmento de nueva alta densidad Y2H. Había construido un nuevo plásmido a las bibliotecas de casa Y2H presa y usado para construir una biblioteca de Y2H altamente compleja hecha de esquilado al azar fragmentos de la DNA genomic de Saccharomyces cerevisiae. Análisis de la secuencia demostró que esta biblioteca tenía sobre 1 millón de diferentes elementos, mucho más complejos que descrita levadura genómica Y2H plásmido bibliotecas¹¹. Con esta nueva biblioteca, hemos sido capaces de demostrar que el flujo de trabajo DEEPN es lo suficientemente robusto como para dar cabida a las bibliotecas del complejo con muchos plásmidos diferentes en una manera fiable y reproducible.