Summary

Un écran de 2-hybride de levure en lot pour comparer les Interactions protéine

Published: June 06, 2018
doi:

Summary

Traitement par lots des écrans 2-hybride de levure permet une comparaison directe des profils interaction de plusieurs protéines d’appât avec un ensemble très complexe de protéines de fusion de proies. Nous décrivons ici des méthodes raffinées, nouveaux réactifs et comment mettre en œuvre leur utilisation pour ces écrans.

Abstract

Dépistage des interactions protéine-protéine à l’aide de l’essai 2-hybride de levure a longtemps été un outil efficace, mais son utilisation a été largement limitée à la découverte des Interactiens de haute affinité qui sont hautement enrichi dans la bibliothèque des candidats qui interagissent. Dans un format traditionnel, le dosage de 2-hybride de levure peut produire trop de colonies à analyser lorsque menée à la raideur bas où se trouvent les Interactiens faible affinité. Par ailleurs, sans un interrogatoire exhaustif et complet de la bibliothèque même contre des plasmides différents appâts, une analyse comparative ne peut être atteint. Bien que certains de ces problèmes peuvent être traités à l’aide de bibliothèques en proie, le coût et l’infrastructure nécessaire pour faire fonctionner ces écrans peuvent être prohibitifs. Comme alternative, nous avons adapté le test 2-hybride de levure pour découvrir en même temps des dizaines de transitoire et interactions de protéine statique au sein d’un seul écran utilisant une stratégie appelée DEEPN (enrichissement dynamique pour réseaux d’évaluation des protéines), qui incorpore le séquençage à haut débit et calcul de suivre l’évolution d’une population de plasmides codant les partenaires qui interagissent. Nous décrivons ici personnalisées réactifs et protocoles qui permettent un écran DEEPN à exécuter facilement et à moindre coût.

Introduction

Une compréhension complète des processus biologiques de cellule s’appuie sur la recherche des réseaux d’interactions protéiques qui sous-tendent leurs mécanismes moléculaires. Une approche pour identifier les interactions entre protéines est la levure 2-hybride (Y2H), qui fonctionne en assemblant un facteur de transcription chimérique fonctionnement une fois que les deux domaines de la protéine d’intérêt lient à un autre1. Un écran Y2H typique est effectué en créant une population de levures qui abrite les deux une bibliothèque des plasmides codant des protéines qui interagissent, fusionnés à un activateur de la transcription (e.g., « la proie » protéine de fusion) et un plasmide de donnée « appât » composé de la protéine d’intérêt fusionné à un domaine de liaison de l’ADN (par exemple, le domaine de liaison à l’ADN de Gal4 qui se lie à la séquence activatrice Gal4-amont). L’un des principaux avantages de l’approche Y2H est qu’il est relativement facile et peu coûteux à réaliser dans un laboratoire typique équipé pour les travaux courants de biologique moléculaire2. Toutefois, lorsque traditionnellement effectué, un utilisateur échantillonne des colonies individuelles qui surviennent après la sélection d’une interaction positive de Y2H. Cela limite fortement le nombre de clones de « proies » de bibliothèque qui peuvent être interrogés. Ce problème est aggravé lorsque l’abondance d’une proie interaction particulière est très élevé par rapport aux autres, ce qui diminue les chances d’apercevoir l’interaction de plasmides de proies de faible abondance.

Une solution pour utiliser le principe Y2H dans une couverture complète du protéome est l’utilisation d’une matrice au format dans lequel un tableau contenant des plasmides de proies individuels connus peut être interrogé numériquement. Toutefois, une telle approche exige une infrastructure qui n’est pas facilement accessible et le plus rentable pour les chercheurs qui s’intéressent à la définition de l’interactome d’un petit nombre de protéines ou domaines3. En outre, bibliothèques de proies très complexe qui peuvent coder plusieurs fragments de protéines qui interagissent augmenterait la taille de tels tableaux matrice aux tailles impraticables. Une alternative consiste à effectuer des essais avec des bibliothèques complexes en lots et d’évaluer la présence de clones interagissants avec le séquençage haut débit parallèle massive4. Ceci peut être appliqué pour doser la présence de plasmides de proies qui se posent dans plusieurs colonies au moyen d’un typique Y2H formaté approche dans laquelle la levure cellules abritant une paire d’interaction des protéines de fusion sont autorisés à cultiver sur un plaque5,6. Cette idée générale peut être accentuée pour augmenter la requête de deux appâts multiples et la proie de composants dans le même temps7,8.

Pourtant, nombreuses enquêtes exigent qu’une plus facile encore plus concentré efforts sur quelques protéines « appâts » et puissent bénéficier davantage par une requête exhaustive et semi-quantitative d’une bibliothèque de proies complexe unique. Nous avons développé et validé une approche pour effectuer des études d’interaction de protéine à grande échelle en utilisant un principe Y2H lot format4. Celui-ci utilise le taux d’expansion d’un plasmide de proie particulière en tant que proxy pour la force relative de Y2H interaction9. Séquençage en profondeur de tous les plasmides au sein d’une population soumise à une croissance normale ou des conditions de croissance sélective produit une carte complète de clones qui donnent des interactions Y2H fortes et faibles. Le répertoire d’interacteurs pouvant être obtenu et directement comparé à travers plusieurs plasmides d’appât. Le flux de travail qui en résulte, appelé DEEPN (dynamique d’enrichissement pour les réseaux d’évaluation des protéines) permet ainsi d’identifier les interactomes différentiels des bibliothèques proies même d’identifier des protéines, permettant la comparaison entre une protéine contre un autre.

Ici, nous démontrons DEEPN et introduire des améliorations dans les méthodes de laboratoire qui facilitent son utilisation, qui sont décrites dans la Figure 1. Des améliorations notables incluent :

Génération de populations de levures proies. Une des exigences clés de DEEPN génère des populations de levure avec des appâts différents plasmides qui ont la même distribution des bibliothèques de proies du plasmide. Les populations de base équivalent de la bibliothèque de plasmide de proies sont essentielles pour faire des comparaisons précises entre les interactomes des appâts différents. C’est plus facilement atteintes qu’un plasmide de bibliothèque occupe déjà une population de levure haploïde et pénétrant un plasmide d’appât donné de cette population est obtenue par croisement pour produire une plante diploïde. Ici, nous fournissons un guide clair dans Comment faire de ces populations en utilisant les librairies commerciales logés chez la levure haploïde. Bien que nous avons trouvé des méthodes qui génèrent un grand nombre d’espèces diploïdes, l’efficacité globale d’accouplement de ces souches de levures commerciales bibliothèque contenant était faible. Par conséquent, nous avons construit une nouvelle souche qui peut accueillir des bibliothèques de la proie qui donne beaucoup plus de diploïdes par réaction d’accouplement.

New jeu de plasmides d’appât. Plusieurs actuelles plasmides exprimant des protéines de fusion « appât » composés de la protéine d’intérêt et un domaine de liaison à l’ADN sont axés sur les 2µ, leur permettant d’amplifier leur nombre de copies. Ce nombre de copies peut être assez variable dans la population et mener à la variabilité de la réponse transcriptionnelle Y2H. Cela pourrait à son tour incliner la capacité de mesurer la force de l’interaction protéine donnée basée sur la réaction de la croissance des cellules sous sélection. Cela peut être en partie adresse à l’aide d’un plasmide de faibles copies, dont certains ont été décrits précédemment tels que le pDEST32 disponible dans le commerce10. Nous avons construit un nouveau plasmide d’appât (pTEF-GBD) qui produit des protéines de fusion Gal4-DNA-binding domain dans un plasmide d’axée sur les centromères faible copie TRP1 porteuses du gène de résistance Kanr qui permet aussi de clonage de fragments d’appâts les deux en amont et en aval du domaine de liaison à l’ADN de Gal4.

Bibliothèque de fragment nouveau High-Density Y2H. Nous avons construit un nouveau plasmide aux bibliothèques de proies Y2H maison et utilisé pour construire une bibliothèque Y2H hautement complexe, faite de fragments cisaillés au hasard de l’ADN génomique de Saccharomyces cerevisiae. Le séquençage a révélé que cette bibliothèque plus 1 million de différents éléments, beaucoup plus complexes que la levure décrite précédemment Y2H génomique plasmidique de bibliothèques11. Avec cette nouvelle bibliothèque, nous avons pu montrer que le flux de travail DEEPN est assez robuste pour accueillir des bibliothèques complexes avec plusieurs plasmides différents de manière fiable et reproductible.

Protocol

1. préparation des plaques et des médias Remarque : Toutes les plaques il faut faire au minimum 2 jours avant de commencer le protocole. Les médias peuvent être faites à tout moment. Toutefois, l’adénine de dextrose peptone tamponnée levure extrait (bYPDA) doit être faite le jour dont il sera utilisé. Certains médias s’effectue avec un mélange de supplément contenant une concentration de l’adénine est supérieure à ce qui est généralement utilisé. La plupart des suppléme…

Representative Results

Le dosage Y2H a été largement utilisé pour trouver des interactions de protéine : protéine et plusieurs adaptations et systèmes ont été développés. Pour l’essentiel, les mêmes considérations qui aident à assurer le succès de ces approches précédentes sont importantes pour DEEPN. Parmi les critères importants : assurer l’expression du domaine de liaison à l’ADN des protéines de fusion, un faible bruit de fond des rayonnements non essentiels à assurer son + crois…

Discussion

Ici, nous fournissons un guide pour savoir comment effectuer les dosages Y2H en lot à l’aide de méthodes optimisées. Il y a quelques étapes cruciales dans la procédure pour s’assurer que la population de levures qui seraient placés sous la sélection est représentatif de la bibliothèque de départ et que suffisamment de la population de levures départ sert à subir une sélection afin de limiter la variabilité . Ce qui est important, ces repères sont relativement faciles à réaliser aux côtés d’adapte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le personnel au sein de l’Institut de génétique humaine de séquençage et de préparation de bibliothèque NGS. Nous remercions Einat Snir pour son expertise dans la préparation des fragments de banque génomique pour la bibliothèque de plasmide Y2H faite ici. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health : NIH R21 EB021870-01 a 1 et de subvention de projet de recherche FNS : 1517110.

Materials

Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain Dr. Robert Piper Lab MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  17. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

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Cite This Article
Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

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