Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.
Screening voor eiwit-eiwitinteractie met behulp van de gist 2-hybrid test is al lang een effectief instrument, maar het gebruik ervan grotendeels beperkt gebleven tot de ontdekking van hoge-affiniteit interactors die in de bibliotheek van interagerende kandidaten zijn hoogverrijkt. In een traditionele indeling, kan de gist 2-hybrid assay opleveren teveel kolonies om te analyseren wanneer uitgevoerd bij lage striktheid waar lage affiniteit interactors kunnen worden gevonden. Bovendien, zonder een uitgebreide en volledige ondervraging van dezelfde bibliotheek tegen verschillende aas plasmiden, een vergelijkende analyse niet worden bereikt. Hoewel sommige van deze problemen kunnen worden opgelost met behulp van gekleed prooi Bibliotheken, kunnen de kosten en de infrastructuur die nodig is om dergelijke schermen onbetaalbaar. Als alternatief hebben we aangepast de gist 2-hybrid bepaling om tegelijkertijd tientallen van voorbijgaande aard bloot te leggen en statische eiwitinteractie binnen één scherm met behulp van een strategie genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de proteïne), die omvat high-throughput DNA sequencing en berekening de ontwikkeling van een populatie van plasmiden, die coderen van interagerende partners te volgen. Hier beschrijven we aangepaste reagentia en protocollen waarmee een DEEPN scherm op eenvoudige en lonende wijze worden uitgevoerd.
Een volledig inzicht in biologische processen van de cel is afhankelijk van het vinden van de Eiwit-interactienetwerken die ten grondslag liggen aan hun moleculaire mechanismen. Een benadering te identificeren eiwitinteractie is de gist 2-hybrid assay (Y2H), die werkt door het monteren van een goed functionerende chimeer transcriptiefactor zodra twee domeinen van de proteïne van belang aan elkaar1 binden. Een typische Y2H scherm wordt uitgevoerd door het creëren van een bevolking van gist dat huizen van beide een bibliotheek van plasmiden, interacterende eiwitten, gesmolten tot een transcriptionele activator codering (bv., ‘prooi’ fusieproteïne) en een bepaalde ‘lokaas’ plasmide bestaat uit het eiwit gesmolten tot een DNA-bindende-domein (bijvoorbeeld, de Gal4 DNA-bindend domein dat zich aan de Gal4-upstream activerend volgorde bindt) van belang. Een van de belangrijkste voordelen van de Y2H-aanpak is dat het is relatief eenvoudig en goedkoop uit te voeren in een typische laboratorium voor moleculaire biologische routinewerk2 uitgerust. Echter als traditioneel uitgevoerd, monsters een gebruiker afzonderlijke kolonies die zich bij de selectie voor een positieve interactie met de Y2H voordoen. Dit beperkt ernstig het aantal bibliotheek ‘prooi’ klonen die kunnen worden onderzocht. Dit probleem wordt nog verergerd wanneer de overvloed aan een bepaalde interactie prooi zeer hoog ten opzichte van de anderen is, het afnemen van de kans op interactie van lage overvloed prooi plasmiden opsporen.
Een oplossing voor het gebruik van het Y2H-beginsel in de uitgebreide dekking van de Proteoom is het gebruik van een matrix-indeling aanpak waarin een array met daarin bekende individuele prooi plasmiden digitaal kan worden ondervraagd. Een dergelijke benadering vereist echter een infrastructuur die niet gemakkelijk toegankelijk te laten of kosteneffectieve aan individuele onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het definiëren van de interactome van een klein aantal proteïnen of domeinen3. Bovendien zou zeer complexe prooi bibliotheken die meerdere fragmenten van interacterende eiwitten kunnen coderen de grootte van deze matrix arrays uitbreiden naar onpraktisch maten. Een alternatief is het uitvoeren van testen met complexe bibliotheken in batches en beoordelen van de aanwezigheid van interagerende klonen met massale parallelle high-throughput sequencing4. Dit kan worden toegepast om de test op de aanwezigheid van plasmiden met prooi, die zich voordoen in meerdere kolonies met behulp van een typische Y2H opgemaakt aanpak in welke gist cellen huisvesting een interactie paar fusion eiwitten zijn toegestaan om te groeien op een plaat5,6. Dit algemene idee kan worden geaccentueerd ter vergroting van de query van beide meerdere aas en prooi onderdelen op de dezelfde tijd7,8.
Toch veel onderzoeken vereisen dat een gemakkelijker nog meer gericht inspanning op slechts een paar eiwit ‘lokaas’ en meer kunnen profiteren door een uitputtende en semi-kwantitatieve-query van een enkele complexe prooi-bibliotheek. Wij hebben ontwikkeld en gevalideerd van een aanpak voor het uitvoeren van grootschalige eiwit interactie studies gebruik te maken van een Y2H principe in batch formaat4. Deze maakt gebruik van het tempo van de expansie van een specifieke prooi plasmide als een proxy voor de relatieve sterkte van Y2H interactie9. Diepe sequentiebepaling van alle plasmiden binnen een populatie onderworpen aan normale groei of selectieve groei omstandigheden produceert een volledige kaart van klonen dat de opbrengst van de sterke en zwakke Y2H interacties. Het repertoire van interactors kan worden verkregen en rechtstreeks met elkaar vergeleken in meerdere aas plasmiden. De resulterende workflow genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de eiwitten) kan dus worden gebruikt om te identificeren van differentiële interactomes uit de dezelfde prooi bibliotheken te identificeren van eiwitten, waardoor vergelijking tussen één eiwit vs. andere.
Hier tonen we DEEPN en verbeteringen in de laboratoriumtechnieken die vergemakkelijken het gebruik ervan, die worden beschreven in Figuur 1. Belangrijke verbeteringen zijn onder andere:
Generatie van prooi gist bevolking. Een van de belangrijkste vereisten van DEEPN is het genereren van populaties van gist met verschillende aas plasmiden die de dezelfde verdeling van de plasmide prooi bibliotheken hebben. Gelijkwaardige basislijn populaties van de prooi plasmide bibliotheek zijn essentieel voor hetgeen een exacte vergelijking tussen de interactomes van verschillende lokaas. Dit gebeurt best bij een plasmide bibliotheek al is gehuisvest in een haploïde gist bevolking en een bepaalde aas plasmide betreden die bevolking wordt bereikt door de paring voor de productie van een diploïde. Wij bieden hier een duidelijke handleiding in hoe te maken van dergelijke populaties commerciële bibliotheken gehuisvest in haploïde gist gebruiken. Hoewel we vonden de methoden die het genereren van een groot aantal ze, was de paring totaalrendement van deze commerciële bibliotheek-bevattende giststammen laag. Dus we hebben gebouwd een nieuwe spanning die kan huis prooi bibliotheken die veel meer ze per paring reactie oplevert.
New set van aas plasmiden. Veel huidige plasmiden die uitdrukking geven aan ‘lokaas’ fusion eiwitten bestaat van de proteïne van belang en een DNA-bindende domein zijn 2µ gebaseerde, waardoor ze hun exemplaaraantal versterken. Deze exemplaaraantal kan heel variabel in de bevolking en leiden tot variabiliteit in het Y2H transcriptionele antwoord. Dit kan op zijn beurt de mogelijkheid om te meten de sterkte van een bepaald eiwit interactie op basis van de reactie van de groei van cellen onder selectie scheeftrekken. Dit kan gedeeltelijk adres met behulp van een laag kopie plasmide, waarvan sommige eerder zoals de verkrijgbare pDEST3210 beschreven zijn. We hebben een nieuwe aas plasmide (pTEF-GBD) die produceert Gal4-DNA-bindende domein fusion eiwitten binnen een TRP1 laag kopie centromeer gebaseerde plasmide uitvoering van het Kanr-resistentie gen waarmee ook klonen van aas fragmenten, zowel stroomopwaarts gebouwd en stroomafwaarts van het domein van Gal4 DNA-bindende.
Nieuwe High-Density Y2H fragment library. We gebouwd een nieuwe plasmide naar huis Y2H prooi bibliotheken en gebruikt het om te bouwen van een uiterst complexe Y2H bibliotheek gemaakt van willekeurig sheared fragmenten van genomic DNA van Saccharomyces cerevisiae. Sequentieanalyse toonde aan dat deze bibliotheek had meer dan 1 miljoen verschillende elementen, veel complexer dan hierboven beschreven gist genomische Y2H plasmide bibliotheken11. Met deze nieuwe bibliotheek waren we kunnen laten zien dat het DEEPN werkstroom robuust genoeg is voor complexe bibliotheken met vele verschillende plasmiden op een wijze die betrouwbaar en reproduceerbaar is.
Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van de Y2H tests in batch met behulp van geoptimaliseerde methoden. Er zijn een paar kritische stappen in de procedure om ervoor te zorgen dat de bevolking van gist die zou worden geplaatst onder selectie representatief voor de startende bibliotheek is en dat genoeg van de startende gist bevolking wordt gebruikt voor het ondergaan van de selectie te beperken variabiliteit . Nog belangrijker is, is deze benchmarks zijn relatief gemakkelijk te bereiken naast de aanpassing van de m…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken het personeel binnen het Instituut voor menselijke genetica voor NGS bibliotheek voorbereiding en sequencing. Wij danken Einat Snir voor haar expertise bij de voorbereiding van genomic bibliotheek fragmenten van de Y2H plasmide bibliotheek gemaakt hier. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 en door NSF onderzoek projectsubsidie: 1517110.
Illumina HiSeq 4000 | Illumina | deep sequencing platform | |
Monoclonal anti-HA antibodies | Biolegend | 901514 | Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs |
Polyclonal anti-myc antibodies | QED Biosciences Inc | 18826 | Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs |
NarI | New England BioLabs | R0191S | |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
BamHI-HF | New England BioLabs | R3236S | |
XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
Polyethylene Glycol 3350, powder | J.T. Baker | U2211-08 | |
Salmon Sperm DNA | Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific | 50-948-286 | carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1. |
Kanamycin Monosulfate | Research Products International | K22000 | |
LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | used for making DNA agarose gels |
Sodium Chloride | Research Products International | S23025 | |
Tryptone | Research Products International | T60060 | |
D-Sorbitol | Research Products International | S23080 | |
Lithium Acetate Dihydrate | MP Biomedicals | 155256 | |
Calcium Chloride | ThermoFisher | C79 | |
EDTA Sodium Salt | Research Products International | E57020 | |
Yeast Extract Powder | Research Products International | Y20020 | |
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids | Research Products International | Y20040 | |
CSM-Trp-Leu+40ADE | Formedium | DCS0789 | |
CSM-Trp-Leu-His+40ADE | Formedium | DCS1169 | |
CSM-Leu-Met | Formedium | DCS0549 | |
CSM-Trp-Met | Bio 101, Inc | 4520-922 | |
L-Methionine | Formedium | DOC0168 | |
Adenine | Research Products International | A11500 | |
D-(+)-Glucose | Research Products International | G32045 | |
Bacto Agar | BD | 214010 | used for making media plates in section 1 |
Peptone | Research Products International | P20240 | |
3-amino-1,2,4 Triazole | Sigma | A8056 | |
2-Mercaptoehanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Zymolyase 100T | USBiological | Z1004 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma | P8281 | |
Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9732 | |
Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 238074 | |
Ethanol | Decon Laboratories, INC | 2716 | |
RNAse A | ThermoFisher | EN0531 | |
Urea | Research Products International | U20200 | |
SDS | Research Products International | L22010 | |
glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
Tris-HCl | Gibco | 15506-017 | |
bromophenol blue | Amresco | 449 | |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510S | Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2 |
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541S | Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1 |
Ethidium Bromide | Amresco | 0492-5G | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Used for purification of pcr products in section 6.2.3 |
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1 |
KAPA Hyper Prep kit | KAPA Biosystems | KK8500 | preparation kit for deep sequencing |
Codon optimization | http://www.jcat.de | ||
Codon optimization | https://www.idtdna.com/CodonOpt | ||
gBlocks | Integrated DNA Technologies | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
Strings | Thermofisher | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit | EPOCH Life Sciences | Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3 | |
Covaris E220 | Covaris | high performance ultra-sonicator in section 7 | |
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
PJ69-4A MatA yeast strain | http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 | MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7 | |
pTEF-GBD | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-DNA binding doimain expression plasmid | |
PLY5725 MATalpha yeast strain | Dr. Robert Piper Lab | MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆ | |
pGal4AD (pPL6343) | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-activation domain expression plasmid | |
100 mm petri dishes | Kord-Vallmark sold by VWR | 2900 | |
125 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63270 | |
250 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63275 | |
20 X 150 mm Disposable Culture Tube | Thermofisher | 14-961-33 | |
pipet-aid | Drummond | 4-000-100 | |
5 mL Serological Pipette | Denville | P7127 | |
10 mL Serological Pipette | Denville | P7128 | |
25 mL Serological Pipette | Denville | P7129 | |
1,000 mL PYREX Griffin Beaker | Fisher Scientific | 02-540P | |
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
1,000 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6G | |
SpectraMax 190 | Molecular Devices | used to measure the Optical Density of cells | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | Spectrophotometer used to quantify amount of DNA |
Electronic UV transilluminator | Ultra Lum | MEB 20 | used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel |
P1000 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123602G | |
P200 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123601G | |
P20 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123600G | |
P10 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F144802G | |
1250 µL Low Retention Pipette Tips | GeneMate | P-1236-1250 | |
200 µLLow Retention Pipette Tips | VWR | 10017-044 | |
10 µL XL Low Retention Pipette Tips | VWR | 10017-042 | |
50 mL conical tube | VWR | 490001-627 | |
15 mL conical tube | VWR | 490001-621 | |
cell scraper | Denville Scientific | TC9310 | |
1.5 mL Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
HCl | Fluka Analytical | 318949-1L | |
NaOH | J.T. Baker | 5674-02 | |
Wooden applicators | Solon Care | 55900 | |
Eppendorf microcentrifuge 5424 | Fisher Scientific | 05-400-005 | microcentrifuge |
Sorvall ST16R | Thermo Fisher Scientific | 75004381 | benchtop centrifuge |
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare | NA934-1ML | Secondary Antibody |
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Secondary Antibody |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | ECL detection solution |
Isotemp Incubator | Thermo Fisher Scientific | Incubator | |
Mutitron 2 | INFORS HT | Shaking incubator | |
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 | Fisher Scientific | water bath | |
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) | Clontech | 630482 | commercially available cDNA Library |
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) | Clontech | 630488 | commercially available cDNA Library |
pGADT7 AD Vector | Clontech | 630442 | commercially available AD Vector housing many cDNA libraries |
pGBKT7 DNA-BD Vector | Clontech | 630443 | commercially available DNA-BD Vector |
Biolase DNA Polymerase | Bioline | BIO-21042 | DNA polymerase used for section 2.4 |
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler | BioExpress | P-6050-60 | pcr machine |
TempAssure 0.5 mL PCR tubes | USA Scientific | 1405-8100 |