تجهيز دفعة من الخميرة 2-الهجين شاشات تسمح بالمقارنة المباشرة لملامح متعددة الطعم البروتينات التفاعل مع مجموعة معقدة جداً من البروتينات الانصهار فريسة. هنا، يمكننا وصف الأساليب المكررة، الكواشف الجديدة، وكيفية تطبيق استخدامها لهذه الشاشات.
الفحص لتفاعلات البروتين البروتين باستخدام مقايسة 2-الهجين الخميرة منذ فترة طويلة أداة فعالة، ولكن إلى حد كبير استخدام محدود لاكتشاف التمثيلات النسب العالية التي يتم التخصيب في مكتبة المرشحين المتفاعلة. في تنسيق تقليدية، يمكن أن تسفر عن التحليل 2-الهجين الخميرة مستعمرات كثيرة جداً لتحليل عندما أجرت في صرامة منخفضة حيث يمكن العثور على التمثيلات تقارب منخفضة. وعلاوة على ذلك، دون استجواب شاملة وكاملة من المكتبة نفسها ضد والبلازميدات الطعم مختلفة، لا يمكن تحقيق إجراء تحليل مقارن. على الرغم من أن بعض هذه المشاكل يمكن معالجتها استخدام مكتبات صفت فريسة، التكلفة والبنية التحتية اللازمة لتشغيل هذه الشاشات يمكن أن تكون باهظة. كبديل لذلك، ونحن قد تكيفت المقايسة 2-الهجين الخميرة في الوقت نفسه كشف العشرات من عابرة وتفاعلات البروتين ثابتة داخل شاشة واحدة استخدام استراتيجية وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين)، التي ويتضمن تسلسل الحمض النووي الفائق وحساب متابعة تطور عدد سكانها والبلازميدات ترميز الشركاء متفاعلة فيما بينها. وهنا يصف لنا الكواشف مخصصة والبروتوكولات التي تسمح شاشة ديبن ليتم تنفيذها بسهولة وفعالية من حيث التكلفة.
فهم كامل للعمليات البيولوجية الخلية يعتمد على إيجاد شبكات التفاعل البروتين التي تكمن وراء تلك الآليات الجزيئية. يتمثل أحد النهج لتحديد تفاعلات البروتين المقايسة الخميرة 2-هجين (Y2H)، الذي يعمل عن طريق تجميع عامل نسخ تشيميريك تعمل بمجرد ربط بين البروتين المجالات ذات الاهتمام ببعضها1. شاشة Y2H نموذجية يتم عن طريق إنشاء عدد أن خميرة التي يضم كل مكتبة من البلازميدات ترميز البروتينات المتفاعلة التي تنصهر فيها منشط النسخي (مثلاً.، ‘فريسة’ البروتين الانصهار) وبلازميد معين ‘طعم’ تتألف من البروتين من مصلحة تنصهر إلى مجال ربط الحمض النووي (مثلاً، Gal4 الحمض النووي ملزم المجال الذي يربط إلى تسلسل تفعيل Gal4 المنبع). واحدة من المزايا الرئيسية للنهج الذي Y2H هو أن من السهل نسبيا وغير مكلفة لقواعد السلوك في مختبر نموذجية مجهزة للعمل الروتيني البيولوجية الجزيئية2. ومع ذلك، عندما تؤدي تقليديا، عينات مستخدم المستعمرات الفردية التي تنشأ عند التحديد لتفاعل إيجابي Y2H. وهذا يحد بشدة من عدد النسخ ‘فريسة’ المكتبة التي يمكن أن تجري دراسة استقصائية. وتتفاقم هذه المشكلة عند وفرة فريسة متفاعلة خاصة مرتفع جداً بالنسبة للآخرين، تتضاءل فرصة للكشف عن التفاعل من وفرة منخفضة فريسة والبلازميدات.
هو حل واحد لاستخدام مبدأ Y2H في تغطية شاملة للبروتين استخدام نهج المهيأة باستخدام مصفوفة حيث يمكن استجوابهم صفيف يحتوي على البلازميدات فريسة الفردية المعروفة رقمياً. ومع ذلك، يتطلب هذا نهج البنية أساسية التي لا يسهل موجوداً أو فعالة من حيث التكلفة للمحققين الأفراد الذين يرغبون في تحديد إينتيراكتومي لعدد قليل من البروتينات أو المجالات3. وباﻹضافة إلى ذلك، ستوسع المكتبات فريسة المعقدة جداً التي قد ترميز أجزاء متعددة من البروتينات المتفاعلة حجم هذه المصفوفات مصفوفة لأحجام غير عملي. وبديل هو إجراء فحوصات مع مكتبات المعقدة على دفعات وتقييم وجود المتفاعلة الحيوانات المستنسخة باستخدام التسلسل الفائق المتوازية الضخمة4. وهذا يمكن تطبيقه على الاعتداء وجود والبلازميدات الجارحة التي تنشأ في مستعمرات متعددة باستخدام نموذجي Y2H نهج يسمح لتنمو على5،لوحة6خلايا الإسكان على زوج متفاعلة من البروتينات الانصهار في الخميرة التي تمت تهيئتها. يمكن أن تتفاقم هذه الفكرة العامة لزيادة الاستعلام من كلا الطعم متعددة وفريسة المكونات في نفس الوقت7،8.
لا يزال العديد من التحقيقات تتطلب أسهل بعد أكثر تركيزاً الجهد على عدد قليل من البروتين ‘الطعم’ ويمكن أن تستفيد أكثر من استعلام حصرية وشبه كمي لمكتبة واحدة فريسة المعقدة. لدينا نمواً والتحقق من صحة نهج لإجراء دراسات التفاعل البروتين على نطاق واسع باستخدام مبدأ Y2H في دفعة الشكل4. هذا يستخدم معدل التوسع بلازميد فريسة معينة كوكيل للقوة النسبية ل التفاعل Y2H9. التسلسل العميق لجميع البلازميدات داخل مجموعة من سكان يتعرضون للنمو الطبيعي أو ظروف النمو الانتقائي وتنتج خريطة كاملة للحيوانات المستنسخة التي تسفر عن التفاعلات Y2H القوية والضعيفة. ويمكن الحصول على المرجع للتمثيلات ومقارنة مباشرة عبر متعددة الطعم والبلازميدات. وبالتالي يمكن استخدام سير العمل الناتجة عن وصف ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم البروتين) لتحديد إينتيراكتوميس التفاضلية من نفس مكتبات فريسة لتحديد البروتينات، مما يتيح المقارنة بين بروتين واحد مقابل آخر.
وهنا نبدي ديبن وإدخال التحسينات في أساليب المختبرات التي يسهل استخدامها، الذي يرد في الشكل 1. تتضمن التحسينات الهامة:
جيل سكان فريسة الخميرة. أحد المتطلبات الرئيسية ديبن يولد سكان خميرة مع البلازميدات الطعم المختلفة التي لها نفس التوزيع للمكتبات فريسة بلازميد. السكان يعادل خط الأساس للمكتبة بلازميد فريسة ضرورية لإجراء مقارنات دقيقة بين إينتيراكتوميس الطعوم المختلفة. وهذا يتحقق على أفضل وجه عندما يقع بلازميد مكتبة الفعل في عدد سكان فرداني خميرة وتتحرك بلازميد طعم معطى إلى أن السكان يتحقق عن طريق التزاوج لإنتاج من مثنوية. وهنا، نحن نقدم دليل واضح في كيفية جعل هؤلاء السكان باستخدام المكتبات التجارية في الخميرة فرداني. على الرغم من أن نجد أساليب توليد عدد كبير من ديبلويدس، وكفاءة التزاوج عموما من هذه السلالات التجارية الخميرة التي تحتوي على مكتبة كان منخفضا. ولذلك، نحن شيدت سلالة جديدة التي يمكن البيت فريسة المكتبات التي تعطي ديبلويدس أكثر بكثير من كل رد فعل التزاوج.
مجموعة جديدة من الطعم والبلازميدات. العديد من البلازميدات الحالية التي تعبر عن ‘الطعم’ الانصهار البروتينات تتألف من البروتين الفائدة ومجال الحمض النووي ملزم تقوم على أساس 2µ، السماح لهم بتضخيم عدد النسخ. يمكن هذا الرقم نسخة متغير تماما في عدد السكان ويؤدي إلى تباين في استجابة النسخي Y2H. وهذا بدوره يمكن أن تحرف القدرة على قياس قوة تفاعل بروتين معين استناداً إلى استجابة نمو الخلايا ضمن التحديد. يمكن أن يكون هذا جزئيا إلى عنوان باستخدام بلازميد نسخة منخفضة، البعض منها قد وصفت سابقا مثل pDEST32 المتاحة تجارياً10. نحن شيدت بلازميد طعم جديد (بتيف-اختطارها) التي تنتج Gal4-الحمض النووي-ملزمة المجال الانصهار البروتينات داخل بلازميد نسخة منخفضة على أساس السنترومير TRP1 تحمل الجينات المقاومة كانر أن يسمح أيضا باستنساخ الأجزاء الطعم المنبع و المتلقين للمعلومات في المجال Gal4 الحمض النووي ملزم.
مكتبة بلغة جديدة الكثافة Y2H. شيدت بلازميد جديد إلى البيت Y2H فريسة المكتبات، وأنها تستخدم لبناء مكتبة Y2H معقدة للغاية مصنوع من شظايا المنفصمة عشوائياً من الحمض النووي من Saccharomyces cerevisiae. أظهر تحليل تسلسل أن مكتبة هذه العناصر المختلفة ما يزيد على 1 مليون، الآن أكثر تعقيداً من الخميرة هو موضح سابقا المجينية Y2H بلازميد المكتبات11. مع هذه المكتبة الجديدة، كنا قادرين على إظهار أن يكون سير العمل ديبن قوية بما يكفي لاستيعاب مكتبات معقدة مع العديد من البلازميدات مختلفة على نحو يعول عليه وقابل لإعادة الإنتاج.
هنا نقدم دليل لكيفية إجراء فحوصات Y2H دفعة واحدة باستخدام طرق محسنة. وهناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في الإجراء للمساعدة على ضمان أن سكان الخميرة التي ستوضع تحت التحديد ممثل مكتبة البداية وأن ما يكفي من السكان الخميرة انطلاق يستخدم الخضوع للتحديد للحد من تقلب . الأهم من ذلك، هذه المقاييس ?…
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر الموظفين داخل معهد “الوراثة البشرية” لإعداد مكتبة خ ع وتسلسلها. ونحن نشكر سنير آنيات لخبرتها في إعداد مكتبة الجينوم الشظايا لمكتبة بلازميد Y2H هنا. هذا العمل كان يدعمها في “المعاهد الوطنية للصحة”: R21 المعاهد الوطنية للصحة EB021870-01A1 و “منحة مشروع بحوث جبهة الخلاص الوطني”: 1517110.
Illumina HiSeq 4000 | Illumina | deep sequencing platform | |
Monoclonal anti-HA antibodies | Biolegend | 901514 | Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs |
Polyclonal anti-myc antibodies | QED Biosciences Inc | 18826 | Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs |
NarI | New England BioLabs | R0191S | |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | |
BamHI-HF | New England BioLabs | R3236S | |
XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
Polyethylene Glycol 3350, powder | J.T. Baker | U2211-08 | |
Salmon Sperm DNA | Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific | 50-948-286 | carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1. |
Kanamycin Monosulfate | Research Products International | K22000 | |
LE Agarose | GeneMate | E-3120-500 | used for making DNA agarose gels |
Sodium Chloride | Research Products International | S23025 | |
Tryptone | Research Products International | T60060 | |
D-Sorbitol | Research Products International | S23080 | |
Lithium Acetate Dihydrate | MP Biomedicals | 155256 | |
Calcium Chloride | ThermoFisher | C79 | |
EDTA Sodium Salt | Research Products International | E57020 | |
Yeast Extract Powder | Research Products International | Y20020 | |
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids | Research Products International | Y20040 | |
CSM-Trp-Leu+40ADE | Formedium | DCS0789 | |
CSM-Trp-Leu-His+40ADE | Formedium | DCS1169 | |
CSM-Leu-Met | Formedium | DCS0549 | |
CSM-Trp-Met | Bio 101, Inc | 4520-922 | |
L-Methionine | Formedium | DOC0168 | |
Adenine | Research Products International | A11500 | |
D-(+)-Glucose | Research Products International | G32045 | |
Bacto Agar | BD | 214010 | used for making media plates in section 1 |
Peptone | Research Products International | P20240 | |
3-amino-1,2,4 Triazole | Sigma | A8056 | |
2-Mercaptoehanol (BME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
Zymolyase 100T | USBiological | Z1004 | |
Potassium phosphate dibasic | Sigma | P8281 | |
Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9732 | |
Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 238074 | |
Ethanol | Decon Laboratories, INC | 2716 | |
RNAse A | ThermoFisher | EN0531 | |
Urea | Research Products International | U20200 | |
SDS | Research Products International | L22010 | |
glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
Tris-HCl | Gibco | 15506-017 | |
bromophenol blue | Amresco | 449 | |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510S | Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2 |
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541S | Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1 |
Ethidium Bromide | Amresco | 0492-5G | |
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Used for purification of pcr products in section 6.2.3 |
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1 |
KAPA Hyper Prep kit | KAPA Biosystems | KK8500 | preparation kit for deep sequencing |
Codon optimization | http://www.jcat.de | ||
Codon optimization | https://www.idtdna.com/CodonOpt | ||
gBlocks | Integrated DNA Technologies | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
Strings | Thermofisher | DNA fragments used for cloning in Section 2.2 | |
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit | EPOCH Life Sciences | Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3 | |
Covaris E220 | Covaris | high performance ultra-sonicator in section 7 | |
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction | |
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
oligonucelotide 5’-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD | |
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
oligonucelotide 5’- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3’ |
Integrated DNA Technologies or Thermofisher | 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7 | |
PJ69-4A MatA yeast strain | http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 | MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7 | |
pTEF-GBD | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-DNA binding doimain expression plasmid | |
PLY5725 MATalpha yeast strain | Dr. Robert Piper Lab | MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆ | |
pGal4AD (pPL6343) | Dr. Robert Piper Lab | Gal4-activation domain expression plasmid | |
100 mm petri dishes | Kord-Vallmark sold by VWR | 2900 | |
125 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63270 | |
250 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63271 | |
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63274 | |
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | S63275 | |
20 X 150 mm Disposable Culture Tube | Thermofisher | 14-961-33 | |
pipet-aid | Drummond | 4-000-100 | |
5 mL Serological Pipette | Denville | P7127 | |
10 mL Serological Pipette | Denville | P7128 | |
25 mL Serological Pipette | Denville | P7129 | |
1,000 mL PYREX Griffin Beaker | Fisher Scientific | 02-540P | |
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle | Fisher Scientific | 06-414-1D | |
1,000 mL graduated cylinder | Fisher Scientific | 08-572-6G | |
SpectraMax 190 | Molecular Devices | used to measure the Optical Density of cells | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | Spectrophotometer used to quantify amount of DNA |
Electronic UV transilluminator | Ultra Lum | MEB 20 | used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel |
P1000 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123602G | |
P200 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123601G | |
P20 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F123600G | |
P10 Gilson PIPETMAN | Fisher Scientific | F144802G | |
1250 µL Low Retention Pipette Tips | GeneMate | P-1236-1250 | |
200 µLLow Retention Pipette Tips | VWR | 10017-044 | |
10 µL XL Low Retention Pipette Tips | VWR | 10017-042 | |
50 mL conical tube | VWR | 490001-627 | |
15 mL conical tube | VWR | 490001-621 | |
cell scraper | Denville Scientific | TC9310 | |
1.5 mL Microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
HCl | Fluka Analytical | 318949-1L | |
NaOH | J.T. Baker | 5674-02 | |
Wooden applicators | Solon Care | 55900 | |
Eppendorf microcentrifuge 5424 | Fisher Scientific | 05-400-005 | microcentrifuge |
Sorvall ST16R | Thermo Fisher Scientific | 75004381 | benchtop centrifuge |
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare | NA934-1ML | Secondary Antibody |
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Secondary Antibody |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific | 34080 | ECL detection solution |
Isotemp Incubator | Thermo Fisher Scientific | Incubator | |
Mutitron 2 | INFORS HT | Shaking incubator | |
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 | Fisher Scientific | water bath | |
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) | Clontech | 630482 | commercially available cDNA Library |
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) | Clontech | 630488 | commercially available cDNA Library |
pGADT7 AD Vector | Clontech | 630442 | commercially available AD Vector housing many cDNA libraries |
pGBKT7 DNA-BD Vector | Clontech | 630443 | commercially available DNA-BD Vector |
Biolase DNA Polymerase | Bioline | BIO-21042 | DNA polymerase used for section 2.4 |
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler | BioExpress | P-6050-60 | pcr machine |
TempAssure 0.5 mL PCR tubes | USA Scientific | 1405-8100 |