Una schermata di 2-ibrido del lievito in Batch per confrontare interazioni proteina

Una comprensione completa dei processi biologici delle cellule si basa sull’individuazione delle reti di interazione della proteina che sono alla base della loro meccanismi molecolari. Un approccio per identificare interazioni della proteina è il dosaggio di lievito 2-ibrido (Y2H), che funziona con l’assemblaggio di un fattore di trascrizione chimerica funzionante una volta due dominii della proteina di interesse associare ad uno altro¹. Una tipica schermata di Y2H viene eseguita mediante la creazione di una popolazione di lievito che ospita sia una libreria di plasmidi che codificano le proteine interagenti fuse ad un attivatore trascrizionale (ad es., ‘preda’ proteina di fusione) e un plasmide dato ‘esca’ composta la proteina di interesse fusa a un dominio di legame del DNA (per esempio, il dominio legante il DNA di Gal4 che lega la sequenza d’attivazione Gal4-upstream). Uno dei principali vantaggi dell’approccio Y2H è che è relativamente facile e poco costoso per condurre in un tipico laboratorio attrezzato per lavoro biologico molecolare routine². Tuttavia, quando tradizionalmente eseguita, un utente campioni diverse colonie che sorgono al momento della selezione per una positiva interazione Y2H. Questo limita fortemente il numero di cloni ‘preda’ libreria che può essere oggetto di indagine. Questo problema è aggravato quando l’abbondanza di una particolare preda interagente è molto alta rispetto alle altre, diminuendo la possibilità di rilevare l’interazione da plasmidi preda abbondanza bassa.

Una soluzione per l’utilizzo del principio di Y2H in una copertura completa del proteoma è l’uso di un approccio di matrice-formattato in cui una matrice contenente noto preda singoli plasmidi possa essere interrogata digitalmente. Tuttavia, tale approccio richiede un’infrastruttura che non è facilmente accessibile e conveniente per diversi ricercatori che sono interessati nella definizione Interactoma di un piccolo numero di proteine o domini³. Inoltre, librerie di prede molto complessa che possono codificare più frammenti di proteine interagenti sarebbero espandere le dimensioni di tali matrici matrice ai formati impraticabile. Un’alternativa consiste nell’eseguire saggi con librerie complesse in lotti e valutare la presenza di cloni interagenti mediante sequenziamento massivo di high throughput parallelo⁴. Questo può essere applicato per analizzare la presenza di prede plasmidi che sorgono nelle colonie multiple utilizzando un tipico Y2H formattato approccio nel quale lievito cellule alloggiamento un interagenti delle proteine di fusione sono autorizzate a crescere su una piastra^5,6. Questa idea generale può essere accentuata per aumentare query di entrambi più esche e prede componenti al stesso tempo^7,8.

Ancora, molte indagini richiedono che un più facile ancora più concentrati sforzo sulla proteina a pochi ‘esche’ e possono beneficiare più di una query esaustiva e semi-quantitativa di una libreria singola preda complessi. Abbiamo sviluppato e convalidato un metodo per eseguire gli studi di interazione della proteina su vasta scala utilizzando un principio di Y2H in batch formato⁴. Questo utilizza il tasso di espansione di un plasmide particolare preda come un proxy per la forza relativa di Y2H interazione⁹. Sequenziamento profondo di tutti i plasmidi all’interno di una popolazione sottoposta alla normale crescita o condizioni di crescita selettiva produce una mappa completa dei cloni che producono interazioni Y2H forti e deboli. Il repertorio di interattori possa essere ottenuto e confrontato direttamente attraverso più esca plasmidi. Il flusso di lavoro risultante definito profondo (arricchimento dinamico per la valutazione della proteina reti) quindi utilizzabile per identificare differenziale Interattomi dalle stesse librerie di preda per identificare le proteine, permettendo un confronto tra una proteina contro un altro.

Qui, noi dimostrare profondo e introdurre miglioramenti nei metodi di laboratorio che facilitano l’uso, che sono illustrati nella Figura 1. Miglioramenti significativi includono:

Generazione di popolazioni lievito preda. Uno dei requisiti chiavi di profondo sta generando popolazioni di lievito con i plasmidi di esche diverse che hanno la stessa distribuzione delle librerie preda del plasmide. Popolazioni di equivalente della linea di base della libreria plasmide preda sono essenziali per effettuare confronti accurati tra l’interattomi di diverse esche. Ciò si ottiene quando un plasmide di biblioteca occupa già una popolazione di lievito aploidi e lo spostamento di un plasmide dato esca in quella popolazione è ottenuto dall’accoppiamento per produrre un diploide. Qui, forniamo una guida chiara su come rendere tali popolazioni utilizzando librerie commerciali ospitate in lievito aploide. Anche se abbiamo trovato metodi che generano un elevato numero di diploidi, l’efficienza complessiva degli amori di questi ceppi di lievito commerciale libreria-contenente era basso. Di conseguenza, abbiamo costruito un nuovo ceppo che può ospitare la preda librerie che produce molto più diploidi per reazione di accoppiamento.

Nuovo set di plasmidi di esca. Molti plasmidi corrente che esprimono proteine di fusione ‘esca’ comprende della proteina di interesse e un dominio di legame al DNA sono basati su 2 µ, permettendo loro di amplificare il loro numero di copia. Questo numero di copia può essere abbastanza variabile nella popolazione e portare alla variabilità della risposta trascrizionale di Y2H. Questo a sua volta potrebbe inclinare la capacità di misurare la forza di un’interazione proteina data sulla base della risposta di crescita delle cellule in selezione. Questo può essere parzialmente indirizzo utilizzando un plasmide copia basso, alcuni dei quali precedentemente sono stati descritti come il pDEST32 commercialmente disponibili¹⁰. Abbiamo costruito un nuovo plasmide esca (pTEF-GBD) che produce proteine di fusione di dominio Gal4-DNA-binding all’interno di un plasmide copia basso basato su centromero TRP1 che trasporta il gene di resistenza Kanr che permette anche la clonazione di frammenti di esca sia a Monte e a valle del dominio legante il DNA di Gal4.

Libreria di frammento di nuovo ad alta densità Y2H. Abbiamo costruito un nuovo plasmide per librerie di casa Y2H preda e usato per costruire una libreria di Y2H altamente complessa composta casualmente tranciati frammenti di DNA genomico da Saccharomyces cerevisiae. Analisi di sequenza ha indicato che questa libreria ha avuto oltre 1 milione di elementi diversi, molto più complessi di lievito precedentemente descritti genomica Y2H plasmide biblioteche¹¹. Con questa nuova libreria, siamo stati in grado di dimostrare che il flusso di lavoro profondo è abbastanza robusto per ospitare librerie complesse con molti plasmidi differenti in modo che sia affidabile e riproducibile.