Summary

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

Published: June 06, 2018
doi:

Summary

עיבוד אצווה של שמרים 2-היברידית מסכים מאפשר השוואה ישירה של הפרופילים האינטראקציה של מספר חלבונים הפיתיון עם סט מורכב של חלבונים פיוז’ן טרף. כאן, אנו מתארים שיטות מעודן, ריאגנטים החדש וכיצד ליישם ושימושם עבור מסכי כזה.

Abstract

הקרנה עבור אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות שמרים 2-היברידית וזמינותו כבר זמן רב כלי יעיל, אך השימוש בה במידה רבה הוגבלה לגילוי של interactors גבוהה-זיקה כי הם מאוד מועשרים בספריה של מועמדים אינטראקציה. בתבנית מסורתית, שמרים 2-היברידית וזמינותו יכולות להניב מושבות רבות מדי לנתח כאשר ניצח ב לכתחילה נמוך שבו זיקה נמוכה interactors שעשויים להימצא. יתר על כן, ללא חקירה מקיפה ושלמה של הספרייה אותו נגד פלסמידים שונים פיתיון, ניתוח השוואתי אינה יכולה להיות מושגת. למרות חלק מבעיות אלו ניתן לטפל באמצעות ספריות טרף ערוכים, עלות והתשתיות הדרושים להפעלת מסכי כזה יכול להיות אסורה. כחלופה, אנו הסתגלו שמרים 2-היברידית וזמינותו לחשוף בו זמנית עשרות ארעי, אינטראקציות חלבון סטטי בתוך מסך אחד ניצול אסטרטגיה כינה DEEPN (העשרה דינמי עבור הערכה של חלבונים רשתות), אשר משלבת רצפי DNA תפוקה גבוהה וחישוביות לעקוב אחר ההתפתחות של אוכלוסיה של פלסמידים אשר קידוד שותפים אינטראקציה. כאן, אנו מתארים ריאגנטים מותאם אישית ופרוטוקולים לאפשר מסך DEEPN להורג בקלות וביעילות.

Introduction

הבנה מלאה של התהליכים הביולוגיים תא מסתמך על מציאת הרשתות אינטראקציית חלבון העומדים בבסיס המנגנונים המולקולריים שלהם. גישה אחת כדי לזהות אינטראקציות חלבון הוא וזמינותו (Y2H) 2-היברידית שמרים, אשר עובד על ידי הרכבת פקטור שעתוק chimeric מתפקדת ברגע חלבון שני, תחומי עניין לאגד בזו1. מסך Y2H טיפוסי מבוצע על-ידי יצירת אוכלוסייה של שמרים כי בתים בשני ספריה של פלסמידים קידוד חלבונים שמעצבת דבוקה מפעיל גנים ברמת השעתוק (למשל., “טרף” חלבון כימרי) ולא על פלסמיד נתון “פיתיון” המורכבת של החלבון עניין התמזגו לתחום איגוד ה-DNA (למשל, התחום Gal4 DNA-איגוד המאגד רצף הפעלת נגד הזרם-Gal4). אחד היתרונות העיקריים של הגישה Y2H היא כי קל יחסית זול לבצע במעבדה טיפוסי מצויד עבור עבודה שוטפת ביולוגית מולקולרית2. עם זאת, כאשר מבוצעת באופן מסורתי, משתמש דוגמאות בודדות מושבות שעולות בעת הבחירה עבור השפעה חיובית הדדית Y2H. זה קשות מגביל את המספר של ספריית “טרף” שיבוטים זה יבדקו. בעיה זו היא הופכת למורכבת יותר כאשר השפע של טרף אינטראקציה מסוימת היא גבוהה מאוד ביחס לאחרים, צמצום הסיכוי של גילוי האינטראקציה של פלסמידים לטרף השפע נמוכה.

פתרון אחד לשימוש העיקרון Y2H ב כיסוי מקיף של פרוטאום הוא השימוש בגישה בתבנית מטריצה שבה מערך המכיל טרף בודדים הידועים פלסמידים יכולים דיגיטלית להיחקר. עם זאת, גישה כזו דורשת תשתית אינו נגיש בקלות או חסכונית לחוקרים בודדים אשר מעוניינים מגדיר את interactome של מספר קטן של חלבונים או תחומים3. בנוסף, ספריות טרף מאוד מורכב יכול לקודד שברים מרובים של חלבונים שמעצבת להרחיב גודל כזה מערכים מטריקס גדלים מעשית. חלופה אחת היא לבצע מבחני עם ספריות מורכבים בקבוצות להעריך את הנוכחות של אינטראקציה שיבוטים שימוש מסיבי מקביל בתפוקה גבוהה רצף4. זה ניתן ליישם assay הנוכחות של פלסמידים טרף העולות מושבות מרובות באמצעות טיפוסי Y2H מעוצב הגישה שמרים אילו תאים דיור בזוג אינטראקציה של חלבונים פיוז’ן רשאים לגדול על צלחת5,6. זה הרעיון הכללי יכול להיות הדגישה להגדיל השאילתה של שני פיתיון מרובים, טרף רכיבים באותו זמן7,8.

עדיין, חקירות רבות דורשות שקל יותר עדיין מתרכז יותר מאמץ רק כמה חלבון “פיתיונות’, יכולים ליהנות יותר על-ידי שאילתת ממצה, חצי כמותית של ספריה טרף מורכבת אחת. יש שפותחה ואנו לאימות גישה לביצוע מחקרים אינטראקציה חלבון בהיקף נרחב באמצעות עיקרון Y2H אצווה תבנית4. זה משתמש קצב התרחבות פלסמיד מסוים טרף כמייצג העוצמה היחסית של האינטראקציה Y2H9. רצף עמוק של פלסמידים כל בתוך אוכלוסיה נתון הצמיחה רגילה או תנאי הגידול סלקטיבי מייצר מפה מלאה של שיבוטים המניבים אינטראקציות Y2H חזקות או חלשות. הרפרטואר של interactors יכול להיות שהושג, בהשוואה ישירות על פני פלסמידים מרובים פיתיון. זרימת העבודה וכתוצאה מכך כינה DEEPN (דינמי העשרה עבור הערכה של חלבונים רשתות) וכך ניתן לזהות interactomes דיפרנציאלית מספריות טרף אותו לזהות חלבונים, המאפשר השוואה בין חלבון אחד לעומת אחר.

. הנה, נדגים DEEPN להציג שיפור שיטות מעבדה זה להקל על השימוש בו, אשר מתוארים באיור1. שיפורים משמעותיים כוללים:

דור של אוכלוסיות השמרים טרף. אחת מהדרישות מפתח של DEEPN מייצר אוכלוסיות של שמרים עם פלסמידים שונים פיתיון שיש מאותה התפלגות של ספריות טרף פלסמיד. אוכלוסיות בסיסית המקבילה של הספרייה פלסמיד טרף חיוניים לייצור מדויק השוואות בין interactomes של פיתיונות שונים. זו מושגת בצורה הטובה ביותר כאשר פלסמיד ספריית שוכן כבר בקרב אוכלוסיה שמרים הפלואידי, לגור פלסמיד הפיתיון נתון של האוכלוסייה הזאת מושגת על ידי הזדווגות לייצר דיפלואידי. כאן, אנו מספקים מדריך ברור באיך להכין כזה אוכלוסיות באמצעות ספריות מסחריים בבניין שמרים הפלואידי. אמנם מצאנו שיטות לייצר מספר רב של diploids, היעילות הכוללת ההזדווגות של מסחרי ספריית המכילים שמרים זנים אלו היה נמוך. לכן, אנחנו נבנה זן חדש אשר יכול בית ספריות טרף המניבה diploids הרבה יותר לכל ההזדווגות התגובה.

ניו סט פתיונות פלסמידים. פלסמידים הנוכחי רבים המבטאים “פיתיון” פיוז’ן חלבונים מורכבת של החלבון של עניין לתחום ה-DNA מחייב הם מבוססי 2µ, ומאפשר להם להגביר את מספר העותק שלהם. מספר עותק זה יכול להיות משתנה מאוד באוכלוסייה, להוביל השתנות בתגובה תעתיק Y2H. זה בתורו יכול להטות את היכולת לאמוד את עוצמת האינטראקציה חלבון נתון בהתבסס על התגובה צמיחה של תאים תחת בחירת. זו יכולה להיות חלקית כתובת על-ידי שימוש של פלסמיד עותק נמוכה, אשר חלקם תוארו קודם לכן כגון זמינים מסחרית pDEST3210. ואנחנו נבנה על חדש פיתיון פלסמיד (pTEF-GBD) מייצרת Gal4 DNA-מחייב תחום היתוך חלבונים בתוך פלסמיד מבוססי צנטרומר עותק נמוך TRP1 נושא את הגן ההתנגדות Kanr המאפשר גם שיבוט של פיתיון קטעים שני במעלה הזרם, במורד הזרם של התחום מחייב Gal4 DNA.

ספריית קטע חדש בצפיפות גבוהה Y2H. אנו נבנה על פלסמיד חדש לספריות טרף Y2H הבית, השתמשו בו כדי לבנות ספרייה Y2H מורכב מסיבים של אקראי הוטו שברי DNA גנומי האפייה. ניתוח רצף הראו כי בספריה זו היה מעל 1 מיליון רכיבים שונים, הרבה יותר מורכב מאשר שמרים שתואר לעיל גנומית Y2H פלסמיד ספריות11. עם הספרייה החדשה, הצלחנו להראות זרימת העבודה DEEPN יציבה מספיק כדי להכיל את ספריות מורכב עם הרבה פלסמידים שונים באופן אמין, לשחזור.

Protocol

1. הכנת לוחות ומדיה הערה: כל לוחות צריך להתבצע מינימלית 2 ימים לפני תחילת בפרוטוקול. התקשורת יכול להתבצע בכל עת. עם זאת, אדנין דקסטרוז (bYPDA) peptone תמצית שמרים במאגר צריך להתבצע ביום שבו ייעשה שימוש. כמה כלי תקשורת נעשית באמצעות שילוב תוסף המכיל רמה של אדנין שגדול מ מה זה משמש בדרך כ…

Representative Results

וזמינותו Y2H כבר בשימוש נרחב לאיתור אינטראקציות חלבון: חלבון, פותחו מספר עיבודים ומערכות. ברוב המקרים, שאותם שיקולי המסייעות להבטיח הצלחה עם הגישות הקודמות האלה חשובים עבור DEEPN. חלק חשוב אמות כוללות: הבטחת ביטוי של תחום ה-DNA מחייב חלבונים פיוז’ן, הבטחת רקע נמוך של כדין שלו + צ…

Discussion

כאן אנו מספקים מדריך כיצד לבצע מבחני Y2H אצווה באמצעות שיטות אופטימיזציה. ישנם כמה צעדים קריטיים במסגרת ההליך כדי לסייע להבטיח כי האוכלוסייה של שמרים כי להימצא תחת הבחירה הוא נציג של הספרייה ההתחלה, כי מספיק של האוכלוסייה שמרים המוצא משמש בתהליך הבחירה כדי להגביל את השתנות . חשוב לציין, אמו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לצוות בתוך המכון לגנטיקה אנושית על הגדרות ספריית הכנה ורצף. אנו מודים עינת שניר על המומחיות שלה בהכנת שברי ספרייה גנומית של הספריה פלסמיד Y2H כאן. עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים: NIH R21 EB021870-01A1, על ידי ה-NSF מחקר פרויקט מענק: 1517110.

Materials

Illumina HiSeq 4000 Illumina deep sequencing platform
Monoclonal anti-HA antibodies Biolegend 901514 Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs
Polyclonal anti-myc antibodies QED Biosciences Inc 18826 Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs
NarI New England BioLabs R0191S
EcoRI-HF New England BioLabs R3101S
BamHI-HF New England BioLabs R3236S
XhoI New England BioLabs R0146S
Polyethylene Glycol 3350, powder J.T. Baker U2211-08
Salmon Sperm DNA Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific 50-948-286 carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.
Kanamycin Monosulfate Research Products International K22000
LE Agarose GeneMate E-3120-500 used for making DNA agarose gels
Sodium Chloride Research Products International S23025
Tryptone Research Products International T60060
D-Sorbitol Research Products International S23080
Lithium Acetate Dihydrate MP Biomedicals 155256
Calcium Chloride ThermoFisher C79
EDTA Sodium Salt Research Products International E57020
Yeast Extract Powder Research Products International Y20020
Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids Research Products International Y20040
CSM-Trp-Leu+40ADE Formedium DCS0789
CSM-Trp-Leu-His+40ADE Formedium DCS1169
CSM-Leu-Met Formedium DCS0549
CSM-Trp-Met Bio 101, Inc 4520-922
L-Methionine Formedium DOC0168
Adenine Research Products International A11500
D-(+)-Glucose Research Products International G32045
Bacto Agar BD 214010 used for making media plates in section 1
Peptone Research Products International P20240
3-amino-1,2,4 Triazole Sigma A8056
2-Mercaptoehanol (BME) Sigma-Aldrich M6250
Zymolyase 100T USBiological Z1004
Potassium phosphate dibasic Sigma P8281
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9732
Ammonium Acetate Sigma-Aldrich 238074
Ethanol Decon Laboratories, INC 2716
RNAse A ThermoFisher EN0531
Urea Research Products International U20200
SDS Research Products International L22010
glycerol Sigma Aldrich G5516
Tris-HCl Gibco 15506-017
bromophenol blue Amresco 449
Gibson Assembly Cloning Kit New England Biolabs E5510S Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix New England Biolabs M0541S Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1
Ethidium Bromide Amresco 0492-5G
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Used for purification of pcr products in section 6.2.3
Qiaquick DNA Gel Extraction Kit Qiagen 28704 Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1
KAPA Hyper Prep kit KAPA Biosystems KK8500 preparation kit for deep sequencing
Codon optimization http://www.jcat.de
Codon optimization https://www.idtdna.com/CodonOpt
gBlocks Integrated DNA Technologies DNA fragments used for cloning in Section 2.2
Strings Thermofisher DNA fragments used for cloning in Section 2.2
GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit EPOCH Life Sciences Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3
Covaris E220 Covaris high performance ultra-sonicator in section 7
oligo nucelotide 5’- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligo nucelotide 5’-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction
oligonucleotide 5’-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD
oligonucelotide 5’-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 5' Pimer used for insert amplification of pGADT7
oligonucelotide 5’- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3’
Integrated DNA Technologies or Thermofisher 3' Pimer used for insert amplification of pGADT7
PJ69-4A MatA yeast strain http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Genomic Libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. GENETICS 1996 144:1425-1436 MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBD Dr. Robert Piper Lab Gal4-DNA binding doimain expression plasmid
PLY5725 MATalpha yeast strain Dr. Robert Piper Lab MATalpha his3∆1 leu2∆0 lys2∆0 ura3∆0 gal4∆ trp1∆ Gal80∆
pGal4AD (pPL6343) Dr. Robert Piper Lab Gal4-activation domain expression plasmid
100 mm petri dishes Kord-Vallmark sold by VWR 2900
125 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63270
250 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63271
1,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63274
2,000 mL PYREX Erlenmeyer flask Fisher Scientific S63275
20 X 150 mm Disposable Culture Tube Thermofisher 14-961-33
pipet-aid Drummond 4-000-100
5 mL Serological Pipette Denville P7127
10 mL Serological Pipette Denville P7128
25 mL Serological Pipette Denville P7129
1,000 mL PYREX Griffin Beaker Fisher Scientific 02-540P
1,000 mL PYREX Reuasable Media Storage Bottle Fisher Scientific 06-414-1D
1,000 mL graduated cylinder Fisher Scientific 08-572-6G
SpectraMax 190 Molecular Devices used to measure the Optical Density of cells
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 Spectrophotometer used to quantify amount of DNA
Electronic UV transilluminator Ultra Lum MEB 20 used to visualize DNA in an Ethidium Bromide agarose gel
P1000 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123602G
P200 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123601G
P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G
P10 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F144802G
1250 µL Low Retention Pipette Tips GeneMate P-1236-1250
200 µLLow Retention Pipette Tips VWR 10017-044
10 µL XL Low Retention Pipette Tips VWR 10017-042
50 mL conical tube VWR 490001-627
15 mL conical tube VWR 490001-621
cell scraper Denville Scientific TC9310
1.5 mL Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
HCl Fluka Analytical 318949-1L
NaOH J.T. Baker 5674-02
Wooden applicators Solon Care 55900
Eppendorf microcentrifuge 5424 Fisher Scientific 05-400-005 microcentrifuge
Sorvall ST16R Thermo Fisher Scientific 75004381 benchtop centrifuge
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare NA934-1ML Secondary Antibody
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Secondary Antibody
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific 34080 ECL detection solution
Isotemp Incubator Thermo Fisher Scientific Incubator
Mutitron 2 INFORS HT Shaking incubator
Isotemp Digital-Control Water Bath Model 205 Fisher Scientific water bath
Y2H mouse cDNA library in Y187 (pan tissue) Clontech 630482 commercially available cDNA Library
Y2H mouse cDNA library in Y187 (mouse brain) Clontech 630488 commercially available cDNA Library
pGADT7 AD Vector Clontech 630442 commercially available AD Vector housing many cDNA libraries
pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech 630443 commercially available DNA-BD Vector
Biolase DNA Polymerase Bioline BIO-21042 DNA polymerase used for section 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal Cycler BioExpress P-6050-60 pcr machine
TempAssure 0.5 mL PCR tubes USA Scientific 1405-8100

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863 (2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47 (2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  17. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Play Video

Cite This Article
Peterson, T. A., Stamnes, M. A., Piper, R. C. A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions. J. Vis. Exp. (136), e57801, doi:10.3791/57801 (2018).

View Video