Inducción y validación de senescencia celular en las células humanas primarias
Summary
Aquí, discutimos una serie de protocolos para la inducción y validación de senescencia celular en células cultivadas. Nos enfocamos en diferentes estímulos de inducción de senescencia y describir la cuantificación de los marcadores comunes asociados a senescencia. Proporcionamos detalles técnicos utilizando fibroblastos como modelo, pero los protocolos se adaptan a varios modelos de celulares.
Abstract
Senescencia celular es un estado de detención permanente ciclo celular activado en respuesta a diversos estímulos nocivos. Activación de la senescencia celular es una de varias condiciones fisiopatológicas, incluyendo supresión tumoral, remodelación y el envejecimiento del tejido. Los inductores de la senescencia celular en vivo se caracterizan todavía mal. Sin embargo, un número de estímulos puede utilizarse para promover la senescencia celular ex vivo. Entre ellos, inductores de senescencia más comunes son agotamiento replicativa, ionizantes y no ionizantes, drogas genotóxicas, estrés oxidativo y desmetilantes y acetylating agentes. Aquí, daremos instrucciones detalladas sobre cómo usar estos estímulos para inducir a los fibroblastos en senescencia. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para diferentes tipos de líneas celulares, incluyendo las células cancerosas y células primarias. También se describen diferentes métodos para la validación de la inducción de senescencia. En particular, nos centramos en la medida de la actividad de la enzima lisosomal asociada a la senescencia de β-galactosidasa (SA-β-gal), la tasa de síntesis de ADN usando 5-ethynyl-2′-desoxiuridina (EdU) incorporación análisis, los niveles de expresión del ciclo celular inhibidores de la p16 y p21 y la expresión y secreción de los miembros del fenotipo secretor Senescence-Associated (spas). Por último, proporcionamos resultados de ejemplo y discutir otras aplicaciones de estos protocolos.
Introduction
En 1961 Hayflick y Moorhead informaron que primaria fibroblastos en cultivo pierden su potencial proliferativo después de pasajes sucesivos1. Este proceso es causado por la reducción secuencial de telómeros después de cada división celular. Cuando los telómeros alcanzan una longitud crítica corta, son reconocidos por la respuesta al daño del ADN (DDR) que activa una detención irreversible de la proliferación, también denominado senescencia replicativa. Senescencia replicativa es actualmente uno de los muchos estímulos que son conocidos por inducir un estado de detención permanente ciclo celular que hace que las células insensibles a los mitógenos y a apoptosis señales2,3. El programa de senescencia se caracteriza normalmente por características adicionales incluyendo alta actividad lisosomal, la disfunción mitocondrial, cambios nucleares, los cambios de la cromatina, estrés de retículo endoplasmático, daño de la DNA y una senescencia asociada fenotipo secretor (spas)3,4. Las células senescentes tienen múltiples funciones en el cuerpo: el desarrollo, la herida cura y tumor supresión2. Igualmente, se sabe que desempeñan un papel importante en el envejecimiento y, paradójicamente, en la progresión de tumor5. Los efectos negativos y parcialmente contradictorios, de senescencia se atribuyen a menudo a los spas6.
Recientemente, fue demostrado que la eliminación de células senescentes en ratones conduce a la extensión de vida útil y a la eliminación de muchos de los envejecimiento características7,8,9,10,11, 12. de la misma manera, se han desarrollado varios fármacos o eliminar las células senescentes (senolytics) o a los spas13,14. El potencial terapéutico contra el envejecimiento recientemente ha atraído más atención al campo.
El estudio de los mecanismos asociados a senescencia celular y las proyecciones para las intervenciones farmacológicas dependen en gran medida en modelos ex vivo , especialmente en fibroblastos humanos primarios. Si bien existen algunas características comunes activados por inductores de senescencia diversos, una gran variabilidad en el fenotipo de senescencia es observado y depende de varios factores incluyendo la célula tipo, estímulo y tiempo punto3,15, 16,17. Es imprescindible considerar la heterogeneidad para estudiar y que dirigida a las células senescentes. Por lo tanto, este protocolo pretende ofrecer una serie de métodos utilizados para inducir la senescencia en fibroblastos primarios mediante el uso de diferentes tratamientos. Como se explicará, los métodos fácilmente adaptables a otros tipos celulares.
Aparte de senescencia replicativa, Describimos cinco otros tratamientos de inducción de senescencia: radiaciones ionizantes, radiación, radiación ultravioleta (UV), la doxorrubicina, el estrés oxidativo y cambios epigenéticos (es decir, la promoción de la acetilación de las histonas o la desmetilación del ADN) . Tanto, la radiación ionizante y la radiación UV causan daño directo del ADN y, en la dosis apropiada, desencadenan senescencia18,19. Doxorrubicina también causa senescencia principalmente por daños en el ADN por intercalando en la DNA y alterar la función de Topoisomerasa II y así detener la DNA reparación mecanismos20. La expresión de genes esenciales para la senescencia es controlada normalmente por la acetilación de las histonas y la metilación del ADN. Como consecuencia, los inhibidores de la histona deacetilasa (p. ej., butirato y SAHA) y ADN desmetilantes (e.g., 5-aza) agentes gatillo senescencia de las células normales21,22.
Por último, cuatro de los marcadores más comunes asociados a las células senescentes se explicará: actividad del senescencia asociada-β-galactosidase (SA-β-gal), tasa de síntesis de ADN por análisis de la incorporación de EdU, la sobreexpresión de los reguladores del ciclo celular y inhibidores de quinasa dependiente de ciclina p16 y p21 y sobreexpresión y secreción de miembros de lo spas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos explicados aquí fueron optimizados para fibroblastos primarios humanos, particularmente las células BJ y WI-38. Los protocolos para la senescencia replicativa, radiaciones ionizantes y doxorrubicina, se han aplicado con éxito a otros tipos de fibroblastos (HCA2 y IMR90) y en otros tipos celulares (es decir neonatales melanocitos y queratinocitos o cardiomiocitos derivados de iPSC) en nuestro laboratorio. Sin embargo, las adaptaciones de los tipos de células adicionales pueden optimizarse ajustando algu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio Demaria para discusiones fructíferas y Thijmen van Vliet para compartir datos y protocolo en la senescencia inducida por UV.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
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