Summary

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Published: June 20, 2018
doi:

Summary

Burada, bir dizi indüksiyon için protokol ve kültürlü hücrelerdeki hücresel yaşlanma doğrulanmasını tartışmak. Biz farklı yaşlanma-inducing uyaranlara üzerinde odaklanmak ve ortak yaşlanma ilişkili işaretçileri miktar açıklayın. Fibroblastlar içerebilen bir model olarak kullanarak teknik ayrıntıları sağlar, ancak iletişim kuralları için çeşitli hücresel modelleri adapte edilebilir.

Abstract

Hücresel yaşlanma kalıcı hücre döngüsü tutuklama farklı zararlı uyaranlara yanıt olarak aktif bir durumdur. Harekete geçirmek-in hücresel yaşlanma tümör giderme, yenileme ve yaşlanma doku dahil olmak üzere çeşitli patofizyolojik koşullar bir özelliğidir. Hücresel yaşlanma vivo içinde indükleyicileri hala kötü karakterizedir. Ancak, bir dizi uyaranlara hücresel yaşlanma ex vivotanıtmak için kullanılabilir. Bunların arasında en yaygın yaşlanma-indükleyicileri ikileştirici bitkinlik, iyonize ve iyonizan radyasyon, genotoksik uyuşturucu, oksidatif stres ve demethylating ve ajanlar acetylating vardır. Burada, bu uyaranlara fibroblastlar yaşlanma ikna etmek için kullanma hakkında ayrıntılı yönergeler sağlayacaktır. Bu iletişim kuralı kolayca primer hücre ve hücre hatları, kanser hücrelerinin de dahil olmak üzere farklı türleri için adapte edilebilir. Biz aynı zamanda yaşlanma indüksiyon doğrulama için farklı yöntemler açıklanmaktadır. Özellikle, biz lizozomal enzim yaşlanma ilişkili β-galaktozidaz (SA-β-gal), 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) birleşme tahlil, ifadesi hücre döngüsünün düzeyi kullanarak DNA sentezi oranı etkinliğini ölçme üzerinde odaklanmak inhibitörleri p16 ve p21 ve ifade ve salgı üye Senescence-Associated salgı fenotip (SASP). Son olarak, örnek sonuçlar sağlar ve uygulamalar bu iletişim kurallarının tartışmak.

Introduction

1961’de Hayflick ve Moorhead kültür birincil fibroblastlar sonra art arda pasajlar1proliferatif potansiyellerini kaybetmek bildirdi. Bu işlem sıralı telomerlerin kısalma her hücre bölünmesi sonra neden olur. Telomerlerin eleştirel kısa uzunluğu ulaştığında, nükleer silahların yayılmasına karşı geri dönüşü olmayan bir tutuklama etkinleştiren DNA hasarı yanıt (DDR) tarafından tanınır — de ikileştirici yaşlanma tanımlanır. İkileştirici yaşlanma Şu anda hücre mitogens hem apoptotik sinyal2,3duyarsız işler kalıcı hücre döngüsü tutuklama durumunu ikna etmek için bilinen birçok uyarinin biridir. Yaşlanma program normalde yüksek lizozomal etkinlik, mitokondrial disfonksiyon, nükleer değişiklikleri, kromatin düzenlemeler, endoplazmik retikulum stres, DNA hasarı ve yaşlanma ilişkili dahil olmak üzere ek özellikler ile karakterizedir salgı fenotip (SASP)3,4. Senescent hücreleri vücutta birden fazla işlevi var: geliştirme, yara iyileşmesi ve tümör bastırma2. Aynı şekilde, yaşlanma ve paradoksal olarak, tümör ilerleme5önemli bir rol oynamak için bilinir. Yaşlanma negatif ve kısmen çelişkili etkileri genellikle için SASP6atfedilen.

Son zamanlarda, bu fareler senescent hücrelerden ortadan kaldırılması ömrü uzatma ve yaşlanma özellikleri7,8,9,10,11, çoğunu ortadan kaldırılması yol gösterildi 12. aynı şekilde, birden çok uyuşturucu da senescent hücreleri (senolytics) ortadan kaldırmak için veya SASP13,14hedeflemek için geliştirilmiştir. Anti-aging tedavi potansiyel son zamanlarda alanına daha fazla dikkat çekti.

Çalışma mekanizmaları için hücresel yaşlanma ilişkili ve farmakolojik müdahaleler için gösterimleri özellikle de insan birincil fibroblastlar ex vivo modellerinde güveniyorsun. Ortak bazı özellikleri farklı yaşlanma indükleyicileri tarafından aktif olmakla birlikte, yaşlanma fenotip büyük bir değişkenlik gözlenen ve hücre türü, uyarıcı ve zaman noktası3,15gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. 16,17. Eğitim ve senescent hücreleri hedefleme için heterojenite düşünün zorunludur. Bu nedenle, bu iletişim kuralı bir dizi farklı tedavileri kullanarak birincil fibroblastlar yaşlanma ikna etmek için kullanılan yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Bunu izah gibi yöntemler kolayca diğer hücre tipleri için adapte edilebilir.

İkileştirici yaşlanma dışında biz beş diğer yaşlanma-inducing tedaviler tarif: iyonlaştırıcı radyasyon, ultraviyole (UV) ışınları, doksorubisin, oksidatif stres ve epigenetik değişiklikler (yani promosyon histon asetilasyon veya DNA demethylation) . Hem, iyonizan radyasyon ve UV radyasyon doğrudan DNA hasarına neden ve yaşlanma18,19uygun doz tetik. Doksorubisin aynı zamanda yaşlanma DNA hasarı üzerinden olmak üzere DNA’ya enterkalasyon tarafından neden olur ve topoizomeraz II işlevi bozmakta ve böylece DNA durdurma mekanizmaları20onarmak. Genlerin yaşlanma için temel ifade normalde histon asetilasyon ve DNA metilasyonu tarafından kontrol edilir. Sonuç olarak, histon deacetylase inhibitörleri (Örneğin, sodyum bütrat ve SAHA) ve DNA demethylating (Örneğin, 5-aza) ajanlar yaşlanma Aksi takdirde normal hücreleri21,22tetikler.

Son olarak, dört senescent hücrelere ilişkili en yaygın veri işaretleyicilerini açıklanacaktır: yaşlanma ilişkili-β-galaktozidaz (SA-β-gal), DNA sentezi tarafından EdU birleşme tahlil, hücre döngüsü düzenleyiciler overexpression oranı etkinlik ve siklin bağımlı kinaz inhibitörleri p16 ve p21 ve overexpression ve SASP üyeleri salgılanmasını.

Protocol

1. genel hazırlık D10 orta hazırlayın. Ek DMEM orta-Glutamax ile % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin (son konsantrasyonu: 100 U/mL). Steril PBS hazırlayın. Su üretici yönergelerine göre tablet geçiyoruz. Otoklav tarafından sterilize. 1 x tripsin hazırlayın. Tripsin Versene EDTA/10 5 mL seyreltik x 1:10 45 ml steril PBS.Not: boyunca protokolünün, kullandığımız yakın olan hücre kültür koşulları fizyolojik koşullar için birincil fibroblastlar. Bu normald…

Representative Results

SA-β-gal senescent fibroblastlar boyama zenginleştirme Β-galaktozidaz (β-gal) bu tüm hücrelerde ifade edilir ve bir optimum pH 4.025,26olan lizozomal bir enzimdir. Ancak, yaşlanma sırasında organellerin Boyutu’nda artırın ve sonuç olarak, β-gal senescent hücreleri birikir. Bu enzim artan miktarda bir suboptimal pH 6,025,<sup …

Discussion

Burada iletişim kuralları insan birincil fibroblastlar için optimize özellikle BJ ve WI-38 hücreleri. İkileştirici yaşlanma, iyonizan radyasyon ve doksorubisin, protokollerde başarıyla uygulanan diğer türlerini fibroblastlar (HCA2 ve IMR90) ve diğer hücre tipleri (Yani yenidoğan melanosit ve Lenfositi veya IPSC elde edilen cardiomyocytes) Bizim laboratuvarda. Ancak, ek hücre tipleri için uyarlamalar numaralı seribaşı hücreleri, yöntemleri ve hücreler ekleme/ayırma için plastik destekler için yar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz üyeleri verimli tartışmalar için yönetici laboratuar ve Thijmen van Vliet veri ve iletişim kuralı UV kaynaklı yaşlanma üzerinde paylaştığınız için teşekkür ederiz.

Materials

DMEM Media – GlutaMAX Gibco 31966-047
Fetal Bovine Serum Hyclone SV30160.03
Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) Lonza DE17-602E
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich SC-202581
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) Ambion AM9937
T75 flask Sarstedt 833911002
Trypsin/EDTA Solution Lonza CC-5012
PBS tablets Gibco 18912-014
1.5 ml microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661-1000EA
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430791
6-well plate Sarstedt 83.3920
24-well plate Sarstedt 83.3922
13mm round coverslips Sarstedt 83.1840.002
Steriflip Merck Chemicals SCGP00525
Cesium137-source IBL 637 Cesium-137γ-ray machine
UV radiation chamber Opsytec, Dr. Göbel BS-02
Doxorubicin dihydrochloride  BioAustralis Fine Chemicals BIA-D1202-1
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 7722-84-1
5-aza-2’-deoxycytidine Sigma-Aldrich A3656
SAHA Sigma-Aldrich SML0061
Sodium Butyrate  Sigma-Aldrich B5887
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Fisher Scientific 7240-90-6
Citric acid monohydrate Sigma-Aldrich 5949-29-1
Sodium dibasic phosphate Acros organics 7782-85-6
Potassium ferrocyanide  Fisher Scientific 14459-95-1
Potassium ferricyanide Fisher Scientific 13746-66-2
Sodium Chloride Merck Millipore 7647-14-5
Magnesium Chloride Fisher Chemicals 7791-18-6
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 111-30-8,7732-18-5
16% formaldehyde (w/v) Thermo-Fisher Scientific 28908
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Lumiprobe 10540
Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) Lumiprobe D1330
Sodium ascorbate Sigma-Aldrich A4034
Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) Sigma-Aldrich 209198
Triton X-100 Acros organics 215682500
TRIS base Roche 11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white  Roche 4729749001
Lightcycler 480 sealing foil  Roche 4729757001
Sensifast Probe Lo-ROX kit  Bioline BIO-84020
UPL Probe Library Sigma-Aldrich Various
Human IL-6 DuoSet ELISA R&D D6050
Bio-Rad TC20 Bio-Rad
Counting slides Bio-Rad 145-0017
Dry incubator Thermo-Fisher Scientific Heratherm
Dimethylformamide Merck Millipore 1.10983
Parafilm 'M' laboratory film Bemis  #PM992
Tweezers
Needles

References

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Play Video

Cite This Article
Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (136), e57782, doi:10.3791/57782 (2018).

View Video