Индукция и проверки клеточного старения в первичных клеток человека
Summary
Здесь мы обсуждаем ряд протоколов для индукции и проверки клеточного старения в культивируемых клеток. Мы ориентируемся на различных раздражителей, вызывающие старение и описать количественного определения общего старения ассоциированных маркеров. Мы предоставляем технические детали, используя фибробластов в качестве модели, но протоколы могут быть адаптированы к различным сотовой модели.
Abstract
Клеточного старения является состояние постоянного клеточного цикла арест активирована в ответ на различные стимулы, повреждения. Активация клеточного старения является отличительной чертой различных патофизиологические условий, включая опухоли подавления, тканей ремоделирования и старения. По-прежнему плохо характеризуются индукторов сотовой старение в естественных условиях . Однако ряд стимулов может использоваться для содействия клеточного старения ex vivo. Среди них наиболее распространенные старение индукторов, репликативной истощения, ионизирующего и неионизирующего излучения, Генотоксичные препараты, оксидативный стресс и demethylating и ацетилировать агентов. Здесь мы предоставим детальные инструкции о том, как использовать эти стимулы, чтобы побудить фибробластов в старение. Этот протокол может быть легко адаптирована для различных типов начальных клеток и клеточных линий, включая раковые клетки. Мы также описывают различные методы для проверки старения индукции. В частности мы сосредоточены на измерение активности лизосомальных ферментов старения-связанные β-галактозидазы (SA-β-gal), скорость синтеза ДНК с помощью 5-ethynyl-2′-дезоксиуридина (EdU) включение анализа уровней экспрессии клеточного цикла Ингибиторы p16 и p21 и выражение и секрецию членов Senescence-Associated секреторной фенотип (SASP). Наконец мы предоставляем пример результаты и обсудить дальнейшие применения этих протоколов.
Introduction
В 1961 году Хейфлик и Moorhead сообщили, что первичный фибробластов в культуре потерять их пролиферативный потенциал после последовательных проходов1. Этот процесс является причиной последовательных укорочение теломер после каждого деления клеток. Когда теломеры достигают критически короткой длины, они признаются в повреждения ДНК ответ (РДР), который активирует необратимым арест распространения — также определен как репликативной старение. Репликативной старения в настоящее время является одним из многих раздражителей, которые известны побудить государство ареста постоянного клеточного цикла, что делает клетки нечувствительны митогены и apoptotic сигналы2,3. Программа старения обычно характеризуются дополнительными функциями, включая высокую активность лизосомальных, митохондриальной дисфункции, ядерные изменения, перераспределений chromatin, эндоплазматического ретикулума стресс, повреждение ДНК и старение связанных секреторный фенотип (SASP)3,4. Стареющей клетки имеют несколько функций в организме: развития, ранение исцеления и опухоли подавления2. Кроме того они известны играть важную роль в старения и, как ни парадоксально, в прогрессии опухоли5. Отрицательный и частично противоречивой, эффекты старения часто приписывают SASP6.
Недавно было показано, что ликвидация стареющей клетки от мышей приводит к продлению жизни и ликвидации многих старения функции7,8,9,10,11, 12. в то же время, несколько препаратов были разработаны для либо устранить стареющей клетки (senolytics) или целевой SASP13,14. Антивозрастной лечебный потенциал недавно привлекло больше внимания к полю.
Изучение механизмов, связанных с сотовой старение и показы для фармакологического вмешательства сильно полагаться на ex vivo модели, особенно на первичной фибробластов. Хотя есть некоторые общие черты, активируются различные старение индукторов, большой изменчивости в старение фенотип наблюдаемыми и зависит от различных факторов, включая ячейки типа, стимулов и времени точки3,15, 16,17. Это необходимо учитывать гетерогенность для изучения и ориентации стареющей клетки. Таким образом этот протокол направлен на обеспечение ряда методов, используемых для вызывают старение в первичной фибробластов с помощью различных методов лечения. Как это будет объяснено, методы может быть легко адаптирована для других типов клеток.
Помимо репликативной старение, мы опишем пять других вызывающих старение лечения: ионизирующего излучения, ультрафиолетовые (УФ) излучения, доксорубицин, оксидативный стресс и эпигеномные изменения (а именно, поощрение ацетилирование гистона или деметилирования ДНК) . Ионизирующего излучения и УФ излучения вызывают прямого повреждения ДНК и, в соответствующих дозах вызывают старение18,19. Доксорубицин также вызывает старение главным образом через повреждения ДНК, интеркалирующие в ДНК и нарушая функцию топоизомеразы II и таким образом остановить ДНК ремонт механизмов20. Экспрессии генов, необходимых для старения обычно контролируется ацетилирование гистона и метилирования дна. Как следствие Ингибиторы гистоновых деацетилаз (например, натрия бутират и Саха) и ДНК-demethylating агентов (например, 5-Аза) вызывают старение в противном случае нормальных клеток21,22.
Наконец, четыре из наиболее распространенных маркеров, связанные для стареющей клетки будет объяснено: активность старение связанные β-галактозидазы (SA-β-gal), скорость синтеза ДНК, EdU включения анализа, гиперэкспрессия регуляторов клеточного цикла и p16 ингибиторы Циклин зависимая киназа p21, гиперэкспрессия и и секрецию членов SASP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы, описанные здесь были оптимизированы для первичной фибробластов, особенно BJ и WI-38 ячеек. Протоколы для репликативной старение, ионизирующего излучения и доксорубицина, успешно применялись к другим типам фибробластов (HCA2 и IMR90) и в других типах клеток (а именно новорожденным ме…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов Demaria лаборатории для плодотворных обсуждений и Thijmen ван Влит для совместного использования данных и протокол на УФ индуцированного старения.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
- Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. , (2016).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
- Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
- Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
- Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
- Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
- Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
- Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
- Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
- Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
- Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
- Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
- Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
- Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
- Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
- Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
- Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
- Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
- Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).
