Induzione e convalida della senescenza cellulare in cellule umane primarie
Summary
Andremo a discutere una serie di protocolli per l’induzione e la convalida della senescenza cellulare in cellule coltivate. Ci concentriamo sui diversi stimoli che inducono la senescenza e descrivere la quantificazione degli indicatori comuni di senescenza-collegata. Forniamo dettagli tecnici usando i fibroblasti come un modello, ma i protocolli possono essere adattati a vari modelli di cellulari.
Abstract
La senescenza cellulare è uno stato di arresto del ciclo cellulare permanente attivato in risposta a diversi stimoli dannosi. Attivazione della senescenza cellulare è un marchio di garanzia di varie condizioni fisiopatologiche, tra cui la soppressione del tumore, tessuto che ritocca e invecchiamento. Gli induttori di senescenza cellulare in vivo sono ancora poco caratterizzati. Tuttavia, un numero di stimoli utilizzabile per promuovere la senescenza cellulare ex vivo. Fra loro, senescenza-induttori più comuni sono esaurimento replicativa, radiazioni ionizzanti e radiazioni non ionizzanti, farmaci genotossici, stress ossidativo e di demethylating e acetilante agenti. Qui, vi forniremo istruzioni dettagliate su come utilizzare questi stimoli per indurre i fibroblasti nella senescenza. Questo protocollo può essere facilmente adattato per diversi tipi di cellule primarie e linee cellulari, comprese le cellule tumorali. Descriviamo anche diversi metodi per la convalida di induzione di senescenza. In particolare, ci concentriamo sulla misurazione dell’attività dell’enzima lisosomiale β-galattosidasi senescenza-collegata (SA-β-gallone), il tasso di sintesi di DNA mediante analisi di incorporazione di 5-Etinil-2′-deoxyuridine (EdU), i livelli di espressione del ciclo cellulare inibitori p16 e p21 e l’espressione e la secrezione dei membri del fenotipo secretivo Senescence (SASP). Infine, forniamo risultati di esempio e discutere ulteriori applicazioni di questi protocolli.
Introduction
Nel 1961, Hayflick e Moorhead segnalato che fibroblasti primari nella cultura perdono il loro potenziale proliferativo dopo successivi passaggi1. Questo processo è causato dalla riduzione sequenza dei telomeri dopo ogni divisione cellulare. Quando i telomeri raggiungono una lunghezza criticamente corta, sono riconosciuti dalla risposta di danno del DNA (DDR) che attiva un arresto irreversibile della proliferazione — anche definito come senescenza replicativa. Senescenza replicativa è attualmente uno dei molti stimoli che sono noti per indurre uno stato di arresto permanente del ciclo cellulare che esegue il rendering di cellule insensibili ai mitogeni sia a segnali apoptotici2,3. Il programma di senescenza è normalmente caratterizzato da funzionalità aggiuntive tra cui alta attività lisosomiale, la disfunzione mitocondriale, cambiamenti nucleari, le riorganizzazioni della cromatina, stress del reticolo endoplasmico, danno del DNA e una senescenza-collegata fenotipo secretivo (SASP)3,4. Le cellule senescenti hanno molteplici funzioni nel corpo: sviluppo, ferita di soppressione del tumore e guarigione2. Allo stesso modo, essi sono noti per svolgere un ruolo importante nell’invecchiamento e, paradossalmente, in progressione di tumore5. Gli effetti negativi e parzialmente contraddittori, di senescenza sono spesso attribuiti alla SASP6.
Recentemente, è stato indicato che l’eliminazione delle cellule senescenti dai topi conduce alla estensione della durata della vita e alla eliminazione di molti l’invecchiamento caratteristiche7,8,9,10,11, 12. allo stesso modo, le droghe multiple sono state sviluppate per eliminare sia le cellule senescenti (senolytics) o per mirare le SASP13,14. Il potenziale terapeutico di anti-invecchiamento ha recentemente attirato più attenzione al campo.
Lo studio dei meccanismi associati a senescenza cellulare e le proiezioni per gli interventi farmacologici si basano pesantemente su modelli ex vivo , particolarmente sui fibroblasti primari umani. Mentre ci sono alcune caratteristiche comuni attivati da induttori di senescenza diversificata, una grande variabilità nel fenotipo di senescenza è osservata e dipende da vari fattori tra cui cella tipo, stimolo e tempo punto3,15, 16,17. È assolutamente necessario prendere in considerazione l’eterogeneità per studiare e targeting cellule senescenti. Di conseguenza, questo protocollo mira a fornire una serie di metodi utilizzati per indurre senescenza in fibroblasti primari utilizzando diversi trattamenti. Come verrà spiegato, i metodi possono essere facilmente adattati ad altri tipi di cella.
Oltre a senescenza replicativa, descriviamo cinque altri trattamenti che induce senescenza: ionizzante radiazione, radiazione ultravioletta (UV), doxorubicina, stress ossidativo ed i cambiamenti epigenetici (vale a dire la promozione di acetilazione dell’istone o demetilazione del DNA) . Entrambi, radiazioni ionizzanti e UV-radiazione causano danni diretti del DNA e, presso la dose appropriata, trigger senescenza18,19. Doxorubicina causa anche senescenza principalmente attraverso il danno del DNA da intercalanti nel DNA e interrompere la funzione di topoisomerasi II e fermando così il DNA riparazione meccanismi20. L’espressione di geni essenziali per la senescenza è normalmente controllato da acetilazione dell’istone e metilazione del DNA. Di conseguenza, gli inibitori dell’istone deacetilasi (ad es., sodio butirrato e SAHA) e DNA demetilanti (ad es., 5-aza) agenti innescano senescenza in cellule altrimenti normali21,22.
Infine, quattro degli indicatori più comuni associati a cellule senescenti sarà spiegato: attività della senescenza associati-β-galattosidasi (SA-β-gallone), tasso di sintesi del DNA dall’analisi di incorporazione di EdU, sovraespressione di regolatori del ciclo cellulare e p16 inibitori di chinasi ciclina-dipendente e p21 e sovraespressione e secrezione dei membri della SASP.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli spiegati qui sono stati ottimizzati per i fibroblasti primari umani, specialmente cellule BJ e WI-38. I protocolli per la senescenza replicativa, radiazioni ionizzanti e doxorubicina, sono stati applicati con successo ad altri tipi di fibroblasti (HCA2 e IMR90) e in altri tipi cellulari (vale a dire neonatali melanociti e cheratinociti o cardiomiociti derivati iPSC) nel nostro laboratorio. Tuttavia, gli adattamenti per i tipi di cellule supplementari possono essere ottimizzati regolando alcuni dettagli come …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i membri del laboratorio Demaria per discussioni fruttuose e Thijmen van Vliet per la condivisione di dati e protocollo sulla senescenza indotta da UV.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
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