التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية
Summary
وهنا، نحن نناقش سلسلة من البروتوكولات لتحريض والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا المستزرعة. نركز على مختلف المحفزات الذي يحفز الشيخوخة ووصف التحديد الكمي للعلامات الشائعة المرتبطة بالشيخوخة. نحن نقدم التفاصيل التقنية باستخدام الخلايا الليفية كنموذج، ولكن البروتوكولات يمكن أن تتكيف مع مختلف النماذج الخلوية.
Abstract
الشيخوخة الخلوية حالة توقيف دورة الخلية الدائمة المنشط في الاستجابة للمحفزات الضارة المختلفة. التنشيط للشيخوخة الخلوية السمة مميزة لمختلف الظروف الفيزيولوجية المرضية بما في ذلك قمع الورم، الأنسجة يعيد البناء والشيخوخة. مستحثات للشيخوخة الخلوية في فيفو تتميز لا يزال ضعيفا. ومع ذلك، يمكن استخدام عدد من المحفزات لتعزيز الشيخوخة الخلوية السابقين فيفو. فيما بينها، هي مستحثات الشيخوخة الأكثر شيوعاً استنفاد replicative الإشعاعات المؤينة وغير المؤينة، وسمية جينية، والأكسدة، وديميثيلاتينج والمخدرات أسيتيلاتينج وكلاء. هنا، سوف نقدم إرشادات مفصلة حول كيفية استخدام هذه المحفزات لحمل الليفية في الشيخوخة. هذا البروتوكول يمكن بسهولة تكييف لأنواع مختلفة من الخلايا الأولية وخطوط الخلايا، بما في ذلك الخلايا السرطانية. ونحن أيضا وصف أساليب مختلفة للتحقق من صحة الاستقراء الشيخوخة. على وجه الخصوص، نحن نركز على قياس نشاط الإنزيم الليزوزومية المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال)، معدل تركيب الدنا باستخدام 5-اثينيل-2 ‘–ديوكسيوريديني (إيدو) إدماج التحليل، مستويات التعبير عن دورة الخلية مثبطات p16 و p21، والتعبير وإفراز أفراد من النمط الظاهري الافرازية سينيسسينسياسوسياتيد (ساسب). وأخيراً، نحن نقدم نتائج المثال ومناقشة المزيد من التطبيقات لهذه البروتوكولات.
Introduction
وأفادت هايفليك ومورهيد في عام 1961، أن الخلايا الليفية الأولية في الثقافة تفقد إمكانياتها التكاثري بعد مقاطع متتالية1. هذه العملية بسبب تقصير التيلومير متسلسلة بعد كل انقسام الخلية. عندما يصل التيلومير إلى مدة قصيرة جداً، يتم التعرف على أنها استجابة تلف الحمض النووي (DDR) التي ينشط فيها القبض لا رجعة فيه من انتشار – كما يعرف الشيخوخة ريبليكاتيفي. الشيخوخة replicative حاليا واحدة من العديد من المحفزات التي هي معروفة لحمل دولة القبض عليه دورة الخلية الدائمة أن يجعل خلايا حساسة إلى ميتوجينس وإلى إشارات apoptotic2،3. برنامج الشيخوخة ويتسم عادة بميزات إضافية بما في ذلك النشاط الليزوزومية عالية وخلل mitochondrial والتغيرات النووية، الكروماتين ترتيبات جديدة، الإجهاد هيولى، أضرار الحمض النووي والمرتبطة الشيخوخة النمط الظاهري الافرازية (ساسب)3،4. مسن الخلايا لها وظائف متعددة في الجسم: التنمية، والجرح الشفاء والورم قمع2. وبالمثل، كانت معروفة لتلعب دوراً هاما في الشيخوخة، ومن المفارقات أنه في تطور الورم5. آثار الشيخوخة سلبية، ومتناقضة جزئيا، وكثيراً ما يعزى إلى ساسب6.
في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن القضاء على الخلايا مسن من الفئران يؤدي إلى تمديد عمر وإلى القضاء على العديد من الشيخوخة ميزات7،،من89،10،11، 12. بنفس الطريقة، تم تطوير أدوية متعددة أما القضاء على الخلايا مسن (سينوليتيكس) أو لاستهداف ال13،ساسب14. إمكانات العلاج المضادة للشيخوخة اجتذبت مؤخرا المزيد من الاهتمام إلى الميدان.
دراسة الآليات المرتبطة بالشيخوخة الخلوية والعروض للتدخلات الدوائية تعتمد بشدة على السابقين فيفو النماذج، لا سيما في الخلايا الليفية الأولية البشرية. بينما هناك بعض السمات المشتركة تنشيطه بواسطة مستحثات الشيخوخة المتنوعة، التقلبات كبيرة في النمط الظاهري الشيخوخة الملاحظة وتعتمد على عوامل مختلفة بما في ذلك الخلية نوع والتحفيز والوقت النقطة3،15، ،من 1617. لا بد من النظر إلى التباين لدراسة واستهداف الخلايا مسن. ولذلك، هذا البروتوكول يهدف إلى توفير مجموعة من الأساليب المستخدمة للحث على الشيخوخة في الخلايا الليفية الأولية باستخدام العلاجات المختلفة. كما سيتم شرح ذلك، يمكن بسهولة أن الأساليب تكييف أنواع الخلايا الأخرى.
وبصرف النظر عن الشيخوخة replicative، يصف لنا خمسة علاجات أخرى يحفز الشيخوخة: الإشعاعات المؤينة الإشعاع والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الإشعاع، ميتوتريكسات، والأكسدة وتغييرات جينية (إلا وهي تعزيز acetylation هيستون أو DNA demethylation) . على حد سواء، من الإشعاع المؤين والإشعاع فوق البنفسجي يسبب ضرر مباشر على الحمض النووي، وفي الجرعة المناسبة، تؤدي إلى الشيخوخة18،19. ميتوتريكسات أيضا لأسباب الشيخوخة أساسا عن طريق الحمض النووي الأضرار التي إينتيركالاتينج في الحمض النووي، وتعطيل وظيفة الثاني توبويسوميراسي، وهكذا وقف الحمض النووي إصلاح آليات20. عادة تسيطر الجينات الأساسية للشيخوخة هيستون acetylation ومثلايشن الحمض النووي. نتيجة لذلك، مثبطات deacetylase هيستون (مثلاً، بوتيرات الصوديوم وساها) والحمض النووي ديميثيلاتينج (مثلاً، 5-عزة) عوامل تؤدي إلى الشيخوخة في الخلايا الطبيعية وإلا21،22.
وأخيراً، سيتم شرح أربعة من العلامات الأكثر شيوعاً المرتبطة بالخلايا مسن: النشاط الشيخوخة المرتبطة-β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال)، المعدل لتركيب الدنا من إيدو إدماج المقايسة، overexpression المنظمين دورة الخلية و كيناز cyclin تعتمد على مثبطات p16 و p21، وأوفيريكسبريشن وإفراز أعضاء ساسب.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكولات وأوضح هنا هي الأمثل للبشرية الليفية الأولية، لا سيما الخلايا BJ وأي-38. بروتوكولات للشيخوخة ريبليكاتيفي والإشعاع المؤين وميتوتريكسات، قد طبقت بنجاح إلى أنواع أخرى من الخلايا الليفية (HCA2 و IMR90)، وفي أنواع أخرى من الخلايا (الخلايا الصباغية هي المواليد والخلايا الكيراتينيه أو cardi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أعضاء المختبر Demaria لمناقشات مثمرة، وليت van ثيجمين لتقاسم البيانات وبروتوكول بشأن الشيخوخة المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية.
Materials
| DMEM Media – GlutaMAX | Gibco | 31966-047 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml) | Lonza | DE17-602E | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | SC-202581 | |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Ambion | AM9937 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833911002 | |
| Trypsin/EDTA Solution | Lonza | CC-5012 | |
| PBS tablets | Gibco | 18912-014 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Corning 15 mL centrifuge tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 6-well plate | Sarstedt | 83.3920 | |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.3922 | |
| 13mm round coverslips | Sarstedt | 83.1840.002 | |
| Steriflip | Merck Chemicals | SCGP00525 | |
| Cesium137-source | IBL 637 Cesium-137γ-ray machine | ||
| UV radiation chamber | Opsytec, Dr. Göbel BS-02 | ||
| Doxorubicin dihydrochloride | BioAustralis Fine Chemicals | BIA-D1202-1 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 7722-84-1 | |
| 5-aza-2’-deoxycytidine | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 | |
| Sodium Butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Fisher Scientific | 7240-90-6 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma-Aldrich | 5949-29-1 | |
| Sodium dibasic phosphate | Acros organics | 7782-85-6 | |
| Potassium ferrocyanide | Fisher Scientific | 14459-95-1 | |
| Potassium ferricyanide | Fisher Scientific | 13746-66-2 | |
| Sodium Chloride | Merck Millipore | 7647-14-5 | |
| Magnesium Chloride | Fisher Chemicals | 7791-18-6 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 111-30-8,7732-18-5 | |
| 16% formaldehyde (w/v) | Thermo-Fisher Scientific | 28908 | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Lumiprobe | 10540 | |
| Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide) | Lumiprobe | D1330 | |
| Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O) | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| Triton X-100 | Acros organics | 215682500 | |
| TRIS base | Roche | 11814273001 | |
| LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white | Roche | 4729749001 | |
| Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
| Sensifast Probe Lo-ROX kit | Bioline | BIO-84020 | |
| UPL Probe Library | Sigma-Aldrich | Various | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D | D6050 | |
| Bio-Rad TC20 | Bio-Rad | ||
| Counting slides | Bio-Rad | 145-0017 | |
| Dry incubator | Thermo-Fisher Scientific | Heratherm | |
| Dimethylformamide | Merck Millipore | 1.10983 | |
| Parafilm 'M' laboratory film | Bemis | #PM992 | |
| Tweezers | |||
| Needles |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
- Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
- Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862 (2016).
- Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. , (2016).
- Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
- Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997 (2015).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
- Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
- Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
- Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
- Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
- Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34 (2016).
- Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531 (2016).
- Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
- Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
- Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
- Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
- Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
- Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2′-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
- Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
- Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
- Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
- Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
- Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
- Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
- Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156 (2017).
- Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188 (2010).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).
