A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi
Summary
Bu iletişim kuralı bir sentetik peptid vitro üzerinden Aβ reaksiyonlar hazırlamak için ve göreli Aβ oligomer miktarda analiz kurutma bir nokta tarafından değerlendirmek için açıklar.
Abstract
Β-amiloid (Aβ) kendi kendine toplamları birleştirmek için içsel bir eğilim ile hidrofobik bir peptit var. Çeşitli toplamları arasında Aβ oligomer yaygın olarak Alzheimer hastalığı (Ah) devam eden önde gelen nörotoksin olarak kabul edilir ve reklam patogenezinde önemli olay olarak kabul edilir. Bu nedenle, Aβ oligomer inhibitörleri ateş önlemek ve hastalık değiştirme olarak geliştirilecek potansiyeline sahip reklam tedaviler. Ancak, farklı oluşumu protokollerin Aβ oligomer reaksiyonlar farklı özelliklere sahip yol açabilir. Ayrıca, etkili bir şekilde ekran Aβ1-42 oligomer inhibitörleri için pek çok yöntem değildir. A11 almışlarsa bir alt kümesiyle toksik Aβ1-42 oligomer Anti-paralel β-sayfa yapıları ile tepki verebilir. Bu protokol için biz nasıl bir sentetik Aβ1-42 peptid vitro bir A11-pozitif Aβ1-42 oligomer zengini örnekten hazırlamak için ve dot blot tarafından göreli A11-pozitif Aβ1-42 oligomer örneklerinde miktarda değerlendirmek için tarif analiz A11 ve Aβ1-42-belirli 6E10 antikorlar. Bu iletişim kuralını kullanan, A11-pozitif Aβ1-42 oligomer inhibitörleri de yarı kantitatif deneysel sonuçlar ekranlı.
Introduction
Alzheimer hastalığı (Ah) yaşlı insanlar dünya çapında1etkileyen en önemli nörodejeneratif hastalıklardan birisidir. β-amiloid (Aβ) anormal toplama reklam önde gelen patolojik etken olabilir yaygın olarak kabul edilir. Aβ toplamları Senil plakalar, bir reklam hastaların beyinlerinin biyolojik işaretleri ana bileşenleri vardır. Ayrıca, Aβ toplamları reaksiyonlar özellikle de dahil olmak üzere, reklam ilerledikçe nöronal ölüm sebebi olabilir güçlü nörotoksisite üretmek. Bu nedenle, Aβ oligomer oluşumu inhibisyonu ateş engelleyebilir ve Aβ oligomer inhibitörleri-var geliştirilen hastalığı olarak değiştirme AD tedaviler. Birçok çalışma sentetik Aβ peptid reaksiyonlar içinde vitroformu, türleri Morfoloji ve yapay Aβ reaksiyonlar yapıları keşfetmek ve vitro modelleri2,3 kullanarak Aβ oligomer inhibitörleri araştırmak için kullanılan , 4. ancak, farklı vitro oluşumu protokolleri Aβ oligomer oligomer farklı araştırma grupları arasında eşsiz sonuçlar neden olabilir farklı morfolojik özelliklere sahip yol açabilir. Bu nedenle, bir standart oluşumu protokol Aβ oligomer için acilen ihtiyacı vardı.
Şimdiye kadar çoğu yöntemleri doğrudan Aβ reaksiyonlar algılamak için rapor edilmiştir. İletim elektronik mikroskobu (TEM), Sigara denaturing Jel Elektroforez, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) ve dot blot Analizi miktar ve/veya morfolojisi Aβ oligomer vitro5, incelemek için kullanılabilir 6. Örneğin, Morfoloji ve Aβ oligomer yapısını TEM içinde görülebilir. Göreli tutarları ve moleküler boyutu Aβ toplamalardan sigara denaturing jel elektroforez tarafından ölçülen. ELISA Aβ oligomer serum, plazma ve beyin dokusu özler belirlemek için kullanılabilir. Son olarak, dot blot analizi, algılamak için kullanılan bir teknik analiz ve proteinler, tanımlama Aβ oligomer farklı örneklerinde göreli yoğunlaşmasını oligomer ve Aβ özgü antikorlar yardımıyla değerlendirmek için kullanılabilir. Jel Elektroforez ve blotting yordamları jeller için gerekli değildir Ayrıca, tahlil kurutma bir nokta önemli zaman tasarrufu sunuyor. Bu nedenle, bu tahlil normalde ekran potansiyel Aβ oligomer inhibitörleri kullanılır. Bu iletişim kuralı genel amacı dot blot Analizi ve ekran Aβ oligomer Aβ1-42 oligomer miktarda çözümlenecek bir Aβ1-42 oligomer zengini örnek, hazırlamak için nispeten basit, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem tarif etmektir Yarı kantitatif deneysel sonuçlar kullanarak inhibitörleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için bir yöntem Aβ1-42 oligomer içeren numune hazırlama ve analiz kurutma bir nokta tarafından A11-pozitif Aβ1-42 oligomer miktarda çözümlemek için bildirdin. Bizim yöntemleri Aβ1-42 oligomer zengini örnekleri hazırlanması için oldukça basit, güvenilir ve tekrarlanabilir olmakla birlikte, hala fark gereken bazı noktalar vardır. İlk olarak, HFIP sentetik Aβ1-42 peptid dağıtmak için kullanılır. Bir araya getirilmiş Aβ1-42 pepti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin’den (U1503223, 81673407, 21475131), kar amacı gütmeyen teknoloji Zhejiang Eyaleti (2016 C 37110), Ningbo uluslararası bilim ve teknoloji üzerinde uygulamalı araştırma projesi hibe tarafından desteklenmiştir İşbirliği projesi (2014D 10019), yaşam bilimleri ve sağlık (2015C 110026), Ningbo bilim ve teknoloji proje yaygın zenginlik (2017C 50042), Li Dak toplamı Yip Yio çene Kenneth Li Marine biyofarmasotik Kalkınma Fonu için Ningbo Belediye yenilik ekibinin, ve Ningbo Üniversitesi’nde K. C. Wong Magna fonu.
Materials
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All – automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer’s beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer’s A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
