إعداد Oligomer بيتا-اميلويد A11-إيجابية وتقييم استخدام دوت النشاف التحليل
Summary
ويصف هذا البروتوكول كيفية إعداد ليغومرات Aβ من ببتيد اصطناعية في المختبر وتقييم الكميات النسبية من Aβ oligomer بنقطة النشاف التحليل.
Abstract
اميلويد بيتا (Aβ) ببتيد مسعور مع اتجاه جوهرية لتجميع ذاتي في المجاميع. بين مجاميع مختلفة، Aβ oligomer مقبول على نطاق واسع عصبي الرائدة في التقدم لمرض الزهايمر (AD) ويعتبر أن الحدث الحاسم في الآلية المرضية للإعلان. ولذلك، قد منع نيوروديجينيريشن مثبطات oligomer Aβ ويمكن أن توضع كالمرض–تعديل علاجات للإعلان. ومع ذلك، تشكيل مختلف بروتوكولات Aβ oligomer قد تؤدي إلى ليغومرات ذات خصائص مختلفة. وعلاوة على ذلك، لا توجد العديد من الطرق لفعالية الشاشة Aβ1-42 مثبطات أوليجومير. يمكن أن يتفاعل جسم A11 مع مجموعة فرعية أوليجومير1-42 Aβ السمية مع هياكل موازية لمكافحة β-ورقة. في هذا البروتوكول، ونحن تصف كيفية إعداد نموذج Aβ A11-إيجابية غنية أوليجومير1-42 من اصطناعية Aβ1-42 ببتيد في المختبر وتقييم كميات نسبية من أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية في عينات من النشاف دوت تحليل استخدام A11 و Aβ1-42-الأجسام المضادة 6E10 محددة. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن أيضا فحص مثبطات أوليجومير1-42 Aβ A11-إيجابية من النتائج التجريبية شبه كمي.
Introduction
مرض الزهايمر (ميلادي) واحد من أهم الأمراض الأعصاب التي تؤثر على كبار السن في جميع أنحاء العالم1. من المقبول على نطاق واسع أن التجميع غير طبيعي من بيتا-اميلويد (Aβ) قد يكون العامل المرضية الرائدة للإعلان. Aβ المجاميع هي المكونات الرئيسية من لويحات خرف، واحدة من علامات بيولوجية في أدمغة المرضى الإعلانية. وعلاوة على ذلك، تنتج المجاميع Aβ، بما في ذلك ليغومرات على وجه الخصوص، السمية العصبية القوية، التي قد يكون سبب الوفاة العصبية كما تقدم الإعلانية. ولذلك، قد منع تثبيط تشكيل oligomer Aβ نيوروديجينيريشن، ويمكن وضع مثبطات oligomer Aβ كالمرض–تعديل علاجات للإعلان. واستخدمت العديد من الدراسات ببتيد Aβ اصطناعية لتشكل ليغومرات في المختبر، واستكشاف مورفولوجيس وهياكل اصطناعية Aβ ليغومرات، والتحقيق مثبطات oligomer Aβ تستخدم في المختبر نماذج2،3 , 4-ولكن مختلفة في المختبر تكوين بروتوكولات Aβ oligomer يمكن أن يؤدي إلى أوليجومير مع الخصائص المورفولوجية المختلفة، مما قد يؤدي إلى نتائج لا تضاهي بين المجموعات البحثية المختلفة. ولذلك، ثمة حاجة ملحة بروتوكول تكوين قياسي ل Aβ oligomer.
حتى الآن، أبلغ عن أساليب كثيرة غير مباشرة الكشف عن ليغومرات Aβ. مجهر إلكتروني (TEM) غير يشوه التفريد جل والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA)، ودوت النشاف التحليل يمكن استخدامها لدراسة كمية و/أو مورفولوجية Aβ oligomer في المختبر5، 6. على سبيل المثال، يمكن ملاحظتها في مورفولوجيا وهيكل Aβ oligomer في TEM. ويمكن قياس الكميات النسبية والحجم الجزيئي لتجميعات Aβ بالتفريد جل غير يشوه. أليسا يمكن استخدامها لتحديد oligomer Aβ في المصل والبلازما، ومقتطفات من أنسجة المخ. وأخيراً، دوت النشاف التحليل، تقنية تستخدم للكشف عن، تحليل وتحديد البروتينات، يمكن استخدامها لتقييم تركيز نسبي oligomer Aβ في عينات مختلفة مع المساعدة من الأجسام المضادة أوليجومير و Aβ محددة. وعلاوة على ذلك، يوفر نقطة النشاف المقايسة قدرا كبيرا من الوقت وفورات، التفريد جل وإجراءات بلوتينج للمواد الهلامية غير مطلوبة. ولذلك، يستخدم هذا الفحص عادة مثبطات oligomer Aβ المحتملة في الشاشة. والهدف العام من هذا البروتوكول وصف طريقة بسيطة نسبيا وموثوق بها، واستنساخه لإعداد نموذج غنية أوليجومير1-42 Aβ، لتحليل كميات أوليجومير1-42 Aβ دوت النشاف التحليل، وعلى الشاشة Aβ oligomer مثبطات استخدام النتائج التجريبية شبه كمي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البروتوكول، أبلغنا طريقة لإعداد العينات التي تحتوي على أوليجومير1-42 Aβ، وتحليل كميات أوليجومير1-42 Aβ A11-الإيجابية بنقطة النشاف تحليل. على الرغم من أن لدينا أساليب لإعداد العينات الغنية أوليجومير1-42 Aβ بسيط جداً، ويمكن الاعتماد عليها، واستنساخه، لا تزال هناك بعض النق…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من “الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين” (U1503223، 81673407، 21475131)، تطبيق مشروع البحث المتعلق بالتكنولوجيا غير ربحية لمقاطعة تشجيانغ (2016 ج 37110)، نينغبوه الدولي للعلم والتكنولوجيا مشروع التعاون (10019 د 2014)، فريق الابتكار بلدية نينغبو لعلوم الحياة والصحة (2015 ج 110026)، علوم نينغبو & مشروع التكنولوجيا للثروة المشتركة (ج 2017 50042)، مجموع داك لي ييب صندوق التنمية الصيدلانية البيولوجية البحرية كينيث لي تشين ييو والصندوق ك جيم وونغ ماجنا في نينغبو جامعة.
Materials
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All – automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer’s beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer’s A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
