Summary

Oligomero di β-amiloide a11-positiva preparazione e valutazione utilizzando Dot Blotting analisi

Published: May 22, 2018
doi:

Summary

Questo protocollo descrive come preparare oligomeri Aβ da un peptide sintetico in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero Aβ da un punto di analisi macchiante.

Abstract

Β-amiloide (Aβ) è un peptide idrofobo con un’intrinseca tendenza ad auto-assemblarsi in aggregati. Tra i vari aggregati, oligomero Aβ è ampiamente accettata come la neurotossina leader nel progresso della malattia di Alzheimer (AD) ed è considerato l’evento cruciale nella patogenesi dell’annuncio. Di conseguenza, Aβ oligomero inibitori potrebbero impedire la neurodegenerazione e hanno il potenziale per essere sviluppato come modificante la malattia trattamenti dell’annuncio. Tuttavia, i protocolli di diversa formazione di oligomeri Aβ potrebbero portare a oligomeri con caratteristiche diverse. Inoltre, non ci sono molti metodi per efficacemente gli inibitori di oligomero del1-42 di schermo Aβ. Un anticorpo A11 può reagire con un sottoinsieme di tossico oligomero di Aβ1-42 con strutture di β-foglio anti-parallelo. In questo protocollo, si descrive come preparare un campione di oligomero-ricco A11-positivi Aβ1-42 da un sintetico Aβ1-42 del peptide in vitro e per valutare la quantità relativa di oligomero di1-42 di Aβ A11-positivi in campioni tamponando un puntino analisi usando A11 e Aβ1-42-6E10 specifici anticorpi. Usando questo protocollo, inibitori dell’oligomero di A11-positivi Aβ1-42 possono essere selezionati anche da risultati sperimentali semi-quantitativa.

Introduction

Morbo di Alzheimer (annuncio) è una delle più importanti malattie neurodegenerative che colpisce le persone anziane nel mondo1. È ampiamente accettato che l’aggregazione anormale di β-amiloide (Aβ) può essere il fattore patologico principale dell’annuncio. Aggregati Aβ sono i componenti principali delle placche senili, uno dei marcatori biologici nei cervelli dei pazienti dell’annuncio. Inoltre, gli aggregati Aβ, oligomeri in particolare, producono neurotossicità potente, che potrebbe essere la causa della morte di un neurone come progredisce AD. Di conseguenza, l’inibizione della formazione di oligomeri Aβ potrebbe impedire la neurodegenerazione e inibitori oligomero Aβ potrebbero essere sviluppati come modificante la malattia trattamenti dell’annuncio. Molti studi hanno utilizzato un peptide Aβ sintetico per formare oligomeri in vitro, esplorare morfologie e strutture degli oligomeri Aβ artificiali e indagare gli inibitori dell’oligomero Aβ utilizzando in vitro modelli2,3 , 4. Tuttavia, protocolli di formazione diversi in vitro dell’oligomero Aβ potrebbero portare a oligomero con differenti caratteristiche morfologiche, che potrebbe causare i risultati incomparabili tra diversi gruppi di ricerca. Di conseguenza, un protocollo di formazione standard per oligomero Aβ è urgentemente necessaria.

Fino ad ora, non ci sono molti metodi sono stati segnalati per rilevare direttamente oligomeri Aβ. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM), gel elettroforesi non-denaturante, analisi enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) e dot blotting analisi può essere utilizzati per esaminare la quantità e/o la morfologia di Aβ oligomero in vitro5, 6. ad esempio, la morfologia e la struttura dell’oligomero Aβ può essere osservati nel TEM. La quantità relativa e dimensioni molecolari delle aggregazioni di Aβ può essere misurate mediante elettroforesi non-denaturante. ELISA potrebbe essere utilizzata per determinare oligomero Aβ in siero, plasma ed estratti dal tessuto cerebrale. Infine, dot blotting analisi, una tecnica utilizzata per la rilevazione, analisi e identificazione di proteine, potrebbe essere utilizzato per valutare la concentrazione relativa di oligomero Aβ in diversi campioni con l’aiuto di anticorpi Aβ-specifiche e oligomero. Inoltre, un dot blotting analisi offre notevole risparmio di tempo, come l’elettroforesi del gel e le procedure macchiante per gel non sono necessari. Pertanto, questa analisi è usata normalmente per potenziali inibitori di oligomero Aβ di schermo. L’obiettivo generale del presente protocollo è di descrivere un metodo relativamente semplice, affidabile e riproducibile per preparare un campione Aβ1-42 oligomero-ricco, di analizzare la quantità di oligomero Aβ1-42 da dot blotting analisi e oligomero Aβ schermo inibitori utilizzando semi-quantitativa di risultati sperimentali.

Protocol

1. soluzione preparazione Nota: Vedere Tabella materiali per le origini di reagente. Preparare una soluzione di 5% albumina di siero bovino (BSA) con l’aggiunta di 5 g di BSA per 100 mL di acqua bidistillata. Mescolare nel Vortex completamente loro. Conservare la soluzione a 4 ° C per 1 mese. Preparare una soluzione di A11 dell’anticorpo anti-oligomero (1:1, 000) aggiungendo 10 µ l di soluzione madre di anticorpo a 10 mL di soluzione di BSA al 5%. Mescola…

Representative Results

Per studiare se un monomero Aβ1-42 può formare un oligomero Aβ1-42 dopo la preparazione, analisi TEM è stata usata. Non aggregati visibili sono stati osservati nel campione HFIP-dissolta Aβ1-42 monomero (Figura 1A). Inoltre, principalmente globulari aggregati con un diametro di circa 10-80 nm sono stati osservati nel campione Aβ1-42 dopo 48 h di agitazione, suggerendo che Aβ1-42 fo…

Discussion

In questo protocollo, abbiamo segnalato un metodo per preparare campioni contenenti oligomero Aβ1-42 e per analizzare la quantità di oligomero di A11-positivi Aβ1-42 da un punto di analisi macchiante. Anche se i nostri metodi per la preparazione di campioni Aβ1-42 oligomero-ricchi sono abbastanza semplici, affidabili e riproducibili, ci sono ancora alcuni punti per essere notato. In primo luogo, HFIP viene utilizzato per sciogliere sintetico peptide Aβ1-42 . Un aggregato p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Natural Science Foundation of China (U1503223, 81673407, 21475131), il progetto di ricerca applicata su tecnologia senza scopo di lucro della provincia del Zhejiang (2016C 37110), Ningbo internazionale di scienza e tecnologia Progetto di cooperazione (2014D 10019), Ningbo comunale Innovation Team del Life Science e salute (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech progetto per ricchezza comune (2017C 50042), il Li Dak somma Yip Yio mento Kenneth Li Marine biofarmaceutica Development Fund, e del fondo di K. C. Wong Magna a Ningbo University.

Materials

A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) Abcam GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) Cell Signalling Technology 2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) Millipore AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)  Beyotime A0208
1-42 GL Biochem 52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol Aladdin I1523078
Curcumin Sigma C1386
Albumin Bovine V Solarbio A8020
Sodium chloride Sangon Biotech D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate SCR 30166428
TRIS Solarbio T8060
Glycine Solarbio G8200
 Dimethyl sulfoxide Solarbio D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker Beyotime P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE Genshare JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane Pall Corporation T50189
Methanol SCR 10014118
Ethanol SCR 10009218
Super low range protein Marker Solarbio PR1300
Transfer Membranes Immobilon-PSQ ISEQ00010
BeyoECL Star Beyotime P0018A
Commassie Blue Fast staining solution Beyotime P0017
All – automatic chemiluminescence imaging system Tanon Tanon 5200
Image J National Institutes of Health
Image processing software Adobe Photoshop CS6
Magnetic agitator Shanghai Huxi

References

  1. Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
  2. De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer’s beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
  4. Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
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Chunhui, H., Dilin, X., Ke, Z., Jieyi, S., Sicheng, Y., Dapeng, W., Qinwen, W., Wei, C. A11-positive β-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57592, doi:10.3791/57592 (2018).

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