Summary

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

Published: May 22, 2018
doi:

Summary

Este protocolo descreve como preparar oligómeros Aβ de um peptídeo sintético em vitro e para avaliar a quantidade relativa de oligómero Aβ por um ponto de análise a mancha.

Abstract

Β-amiloide (Aβ) é um peptídeo hidrofóbico com uma tendência intrínseca de auto-montagem em agregados. Entre vários agregados, oligómero Aβ é amplamente aceita como a neurotoxina principal no progresso da doença de Alzheimer (AD) e é considerado o evento crucial na patogênese da AD. Portanto, inibidores de oligómero Aβ podem impedir a neurodegeneração e têm o potencial para ser desenvolvido como doença-modificando tratamentos de AD. No entanto, protocolos de formação diferente do oligómero Aβ podem levar a oligômeros com características diferentes. Além disso, não existem muitos métodos para efetivamente tela Aβ1-42 oligómero inibidores. Um anticorpo A11 pode reagir com um subconjunto de tóxico oligómero de1-42 de Aβ com estruturas de β-folha antiparalelos. Neste protocolo, descrevemos como preparar uma amostra de oligómero ricos A11-positivo Aβ1-42 de um sintético Aβ1-42 peptídeo em vitro e avaliar quantidades relativas de oligómero de1-42 Aβ A11-positivo em amostras por uma mancha do ponto análise usando A11 e Aβ1-42-anticorpos específicos 6E10. Usando este protocolo, inibidores de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo podem também projectados de semi-quantitativa de resultados experimentais.

Introduction

A doença de Alzheimer (AD) é uma das doenças neurodegenerativas mais importantes que afetam as pessoas idosas no mundo1. É amplamente aceito que a agregação anormal de β-amiloide (Aβ) pode ser o principal factor patológico do anúncio. Aβ agregados são os principais componentes das placas senis, dentre os marcadores biológicos nos cérebros de pacientes. Além disso, agregados Aβ, nomeadamente oligómeros, produzem neurotoxicidade potente, que pode ser a causa da morte neuronal no decorrer AD. Portanto, a inibição da formação de oligómero Aβ pode impedir a neurodegeneração e inibidores Aβ oligómero poderiam ser desenvolvidos como doença-modificando tratamentos de AD. Muitos estudos têm usado um peptídeo sintético de Aβ para formar oligômeros em vitro, explorar morfologias e estruturas de oligômeros Aβ artificiais e investigar os inibidores do oligómero Aβ usando em vitro modelos2,3 , 4. no entanto, diferentes em vitro protocolos de formação do oligómero Aβ podem levar a oligómero com diferentes características morfológicas, o que pode causar os resultados incomparáveis entre grupos de pesquisa diferentes. Portanto, um protocolo de formação standard para oligómero Aβ é urgentemente necessária.

Até agora, não há muitos métodos têm sido relatados para detectar diretamente oligómeros Aβ. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM), não-desnaturação electroforese do gel, ensaio imunoenzimático (ELISA) e ponto de análise a mancha podem ser usados para examinar a quantidade e/ou morfologia de Aβ oligómero 5, 6. por exemplo, a morfologia e estrutura do oligómero Aβ podem ser observados na temperatura. Os montantes relativos e tamanho molecular de agregações de Aβ poderiam ser medidos pela electroforese do gel não-desnaturação. ELISA poderia ser usada para determinar oligómero Aβ em soro, plasma e excertos do tecido cerebral. Por último, ponto de análise, uma técnica utilizada para a detecção, a mancha analisando e identificando as proteínas, poderia ser usado para avaliar a concentração relativa de oligómero Aβ nas diferentes amostras com a ajuda do oligómero-Aβ específicas e de anticorpos. Além disso, um ponto do ensaio de mancha oferece economia de tempo significativo, como a electroforese do gel e os mancha procedimentos para géis não são necessários. Portanto, este ensaio é normalmente usada para tela potenciais Aβ oligómero inibidores da. O objetivo geral do presente protocolo é para descrever um método relativamente simples, confiável e reprodutível para preparar uma amostra da rica oligómero Aβ1-42 , para analisar as quantidades de oligómero Aβ1-42 por ponto de análise a mancha e para oligómero Aβ tela usando os resultados experimentais semi-quantitativa de inibidores.

Protocol

1. preparação da solução Nota: Consulte a Tabela de materiais para fontes de reagente. Prepare uma solução de 5% albumina de soro bovino (BSA) pela adição de 5 g de BSA para 100 mL de água bidestilada. Misturá-los completamente vortexing-los. Armazene a solução a 4 ° C por até 1 mês. Prepare uma solução de A11 de anticorpo antioligómero (1:1, 000), adicionando 10 µ l de solução-mãe de anticorpo para 10 mL da solução de 5% de BSA. Mis…

Representative Results

Para investigar se um monômero de1-42 de Aβ pode formar um oligómero de1-42 de Aβ após preparação, utilizou-se análise de temperatura. Não agregados visíveis foram observados na amostra de monômero de1-42 de Aβ HFIP-dissolvido (Figura 1A). Além disso, principalmente globulares agregados com um diâmetro de ao redor 10-80 nm foram observados na amostra1-42 Aβ após 48 h de tremer, suger…

Discussion

Neste protocolo, registramos um método para preparar amostras contendo oligómero Aβ1-42 e analisar as quantidades de oligómero de1-42 de Aβ A11-positivo por um ponto de análise a mancha. Embora nossos métodos para a preparação de amostras de ricos oligómero Aβ1-42 são bastante simples, confiáveis e reprodutíveis, existem ainda alguns pontos para ser notado. Em primeiro lugar, HFIP é usado para dissolver o péptido sintético de1-42 de Aβ. Um peptídeo de1-4…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (U1503223, 81673407, 21475131), o projeto de pesquisa aplicada na tecnologia sem fins lucrativos de Zhejiang província (2016C 37110), Ningbo Internacional de ciência e tecnologia Projecto de cooperação (2014D 10019), a equipe de inovação Municipal de Ningbo da ciência da vida e saúde (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech projeto riqueza comum 2017C 50042, Li Dak soma Yip Chin Yio Kenneth Li Marine biofarmacêutica fundo de desenvolvimento, e o fundo de K. C. Wong Magna na Universidade de Ningbo.

Materials

A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) Abcam GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) Cell Signalling Technology 2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) Millipore AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)  Beyotime A0208
1-42 GL Biochem 52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol Aladdin I1523078
Curcumin Sigma C1386
Albumin Bovine V Solarbio A8020
Sodium chloride Sangon Biotech D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate SCR 30166428
TRIS Solarbio T8060
Glycine Solarbio G8200
 Dimethyl sulfoxide Solarbio D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker Beyotime P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE Genshare JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane Pall Corporation T50189
Methanol SCR 10014118
Ethanol SCR 10009218
Super low range protein Marker Solarbio PR1300
Transfer Membranes Immobilon-PSQ ISEQ00010
BeyoECL Star Beyotime P0018A
Commassie Blue Fast staining solution Beyotime P0017
All – automatic chemiluminescence imaging system Tanon Tanon 5200
Image J National Institutes of Health
Image processing software Adobe Photoshop CS6
Magnetic agitator Shanghai Huxi

References

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Chunhui, H., Dilin, X., Ke, Z., Jieyi, S., Sicheng, Y., Dapeng, W., Qinwen, W., Wei, C. A11-positive β-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57592, doi:10.3791/57592 (2018).

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