A11-positiver β-Amyloid Oligomer Vorbereitung und Bewertung mit Dot-Blot-Analyse
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Aβ Oligomere aus einem synthetischen Peptid in Vitro vorzubereiten und relative Mengen der Aβ Oligomer durch eine Dot-Blot-Analyse zu bewerten.
Abstract
Β-Amyloid (Aβ) ist eine hydrophobe Peptid mit innewohnende Tendenz zu Aggregaten selbst zusammenstellen. Unter den verschiedenen Aggregaten Aβ Oligomer ist weithin anerkannt als der führende Nervengift in der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit (AD) und gilt als das entscheidende Ereignis in der Pathogenese der AD. Daher könnte Aβ-Oligomer-Inhibitoren verhindern Neurodegeneration und haben das Potenzial, als Disease modifying entwickelt werden Behandlungen von AD. Jedoch führen verschiedene Bildung Protokolle von Aβ Oligomer Oligomere mit unterschiedlichen Eigenschaften. Darüber hinaus gibt es nicht viele Methoden, um effektiv Bildschirm Aβ1-42 Oligomer-Inhibitoren. Ein A11 Antikörper reagieren mit einer Teilmenge der giftige Aβ-1-42 -Oligomer mit antiparallele β-Sheet-Strukturen. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zur Vorbereitung einer A11-positiven Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe aus einem synthetischen Aβ1-42 Peptid in Vitro und relative Mengen der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer in Proben von einem Dot-Blot auswerten Analyse mit A11 und Aβ1-42-spezifischen 6E10 Antikörper. Unter Verwendung dieses Protokolls, können Inhibitoren der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer auch von semi-quantitativen experimentellen Ergebnisse gezeigt.
Introduction
Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der wichtigsten neurodegenerativen Erkrankungen bei älteren Menschen weltweit1. Es ist weithin anerkannt, dass die abnorme Ansammlung von β-Amyloid (Aβ) möglicherweise der führenden pathologischen Faktor von AD. Aβ-Aggregate sind die Hauptbestandteile der senilen Plaques, eines biologischen Markern in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten. Darüber hinaus produzieren Aβ-Aggregate, insbesondere Oligomere potente Neurotoxizität, die möglicherweise die Ursache des neuronalen Tod AD Fortschreiten. Daher könnte die Hemmung der Aβ Oligomer Bildung Neurodegeneration verhindern und Aβ-Oligomer-Inhibitoren entwickelt werden könnte, als krankheitsmodifizierende Therapien von AD. Viele Studien haben eine synthetische Aβ-Peptid bilden Oligomere in Vitro, Morphologien und Strukturen der künstlichen Aβ Oligomere erkunden und untersuchen die Inhibitoren von Aβ-Oligomer mit in-vitro- Modelle2,3 verwendet , 4. jedoch verschiedene in-vitro- Bildung-Protokolle von Aβ Oligomer könnte zu Oligomer mit unterschiedlichen morphologischen Eigenschaften, die die unvergleichliche Ergebnisse unter verschiedenen Forschungsgruppen verursachen könnten. Ein standard-Formation-Protokoll für Aβ Oligomer ist daher dringend erforderlich.
Bis jetzt wurden nicht viele Methoden berichtet, Aβ Oligomere direkt zu erkennen. Übertragung elektronischer Mikroskopie (TEM), nicht Denaturierung Gelelektrophorese, Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) und Dot-Blot-Analyse lässt sich die Menge und/oder die Morphologie von Aβ Oligomer in-vitro-5, prüfen 6. Z. B. die Morphologie und Struktur der Aβ Oligomer in TEM beobachtet werden. Die relativen Mengen und Molekülgröße Aβ Aggregationen konnte nicht Denaturierung Gelelektrophorese gemessen werden. ELISA konnte zur Aβ Oligomer in Serum, Plasma und Auszüge aus Hirngewebe herangezogen werden. Zu guter Letzt Dot-Blot-Analyse, eine Technik zur Erfassung, Analyse und Identifizierung von Proteinen, ließe sich die relative Konzentration der Aβ Oligomer in verschiedenen Proben mit Hilfe von Oligomer-spezifische und Aβ-spezifische Antikörper zu bewerten. Darüber hinaus bietet ein Dot Blot Assay deutliche Zeitersparnis, wie Gelelektrophorese und den befleckenden Verfahren für Gele nicht erforderlich sind. Daher wird dieser Test normalerweise Bildschirm potenzielle Aβ Oligomer-Inhibitoren. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine relativ einfache, zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Vorbereitung einer Aβ1-42 Oligomer-reiche Probe, die Mengen von Aβ-1-42 -Oligomer von Dot-Blot-Analyse und Bildschirm Aβ Oligomer analysieren zu beschreiben Inhibitoren mit semi-quantitativen experimentellen Ergebnissen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir eine Methode zur Vorbereitung von Proben mit Aβ1-42 Oligomer und die Beträge der A11-positiven Aβ1-42 Oligomer durch einen Punkt Blot Analyse analysieren berichtet. Obwohl unsere Methoden für die Erstellung von Aβ1-42 Oligomer-reiche Proben ganz einfach, zuverlässig und reproduzierbar sind, gibt es noch einige Punkte zu beachten. Erstens wird HFIP verwendet, um synthetische Aβ-1-42 -Peptid auflösen. Eine aggregierte Aβ-1-42 -Pep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Natural Science Foundation of China (U1503223, 81673407, 21475131), das angewandte Forschungsprojekt auf Non-Profit-Technologie der Provinz Zhejiang (2016 C 37110), die Ningbo International Science and Technology Kooperationsprojekt (2014D 10019), Ningbo Municipal Innovationsteams der Life Science und Gesundheit (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech-Projekt für Common Wealth (2017C 50042), die Li Dak Summe Yip Yio Kinn Kenneth Li Marine biopharmazeutische Entwicklungsfonds, und K. C. Wong Magna Fonds an Ningbo University.
Materials
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All – automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
- Lauren, J. Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 38 (2), 227-244 (2014).
- De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70. Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).
- Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer’s beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
- Xiang, S. Y., et al. Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).
- Chang, L., et al. Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin. Scientific Reports. 5, 10256 (2015).
- Yam, G. H. F., et al. In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).
- Tomaselli, S., et al. The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer’s A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding. ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).
- Shigemitsu, Y., et al. Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol. Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).
- Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin. International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).
- Fang, F., et al. 5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34. Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).
- Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology. Food & Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).
