Summary

A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis

Published: May 22, 2018
doi:

Summary

Este protocolo describe cómo preparar oligómeros de Aß de un péptido sintético en vitro y evaluar cantidades relativas de oligómero Aβ mediante un punto de análisis el borrar.

Abstract

Β-amiloide (Aβ) es un péptido hidrofóbico con una tendencia intrínseca a la uno mismo-montar en agregados. Entre los diversos agregados, oligómero Aβ es ampliamente aceptado como la neurotoxina líder en el progreso de la enfermedad de Alzheimer (EA) y es considerado como el evento crucial en la patogenia de la EA. Por lo tanto, inhibidores de oligómero Aβ podrían prevenir la neurodegeneración y tienen el potencial para desarrollarse como modificadores de la enfermedad tratamientos de AD. Sin embargo, protocolos de formación diferentes de oligómero Aβ pueden dar oligómeros con diferentes características. Por otra parte, no hay muchos métodos con eficacia pantalla Aβ1-42 oligómero inhibidores de. Un anticuerpo A11 puede reaccionar con un subconjunto de tóxicos oligómero Aβ1-42 con estructuras de β-hoja de la URL. En este protocolo, se describe cómo preparar una muestra de ricos oligómero A11 positivo Aβ1-42 de un sintético Aβ1-42 péptido en vitro y para evaluar las cantidades relativas de oligómero de A11 positivo Aβ1-42 en muestras frotando un punto Análisis usando A11 y Aβ1-42-6E10 específico anticuerpos. Mediante este protocolo, inhibidores de oligómero de A11 positivo Aβ1-42 pueden también proyectará a partir de resultados experimentales semi-cuantitativo.

Introduction

Enfermedad de Alzheimer (EA) es una de las más importantes enfermedades neurodegenerativas que afectan a personas mayores en todo el mundo1. Es ampliamente aceptado que la agregación anormal de β-amiloide (Aβ) puede ser el factor patológico principal del anuncio. Agregados de Aß son los principales componentes de las placas seniles, uno de los marcadores biológicos en el cerebro de pacientes con EA. Por otra parte, agregados de Aß, oligómeros en particular producen neurotoxicidad potente, que pudo ser la causa de la muerte neuronal como progresa AD. Por lo tanto, la inhibición de la formación de Aß oligómero puede prevenir la neurodegeneración, e inhibidores del oligómero de Aß podrían desarrollarse como modificadores de la enfermedad tratamientos de AD. Muchos estudios han utilizado un péptido Aß sintético para formar oligómeros en vitro, explorar morfologías y estructuras de oligómeros de Aß artificiales e investigar los inhibidores de oligómero Aβ usando in vitro modelos2,3 , 4. sin embargo, diferentes en vitro protocolos de formación de oligómero Aβ podrían conducir a oligómero con características morfológicas diferentes, que pueden causar los resultados incomparables entre diferentes grupos de investigación. Por lo tanto, un protocolo de formación estándar de oligómero Aβ es urgente.

Hasta ahora, no muchos métodos se han divulgado para detectar directamente los oligómeros de Aß. Microscopía electrónica de transmisión (TEM), no desnaturalizando electroforesis del gel, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) y dot blotting análisis pueden usarse para examinar la cantidad y morfología de Aβ oligómero en vitro5, 6. por ejemplo, la morfología y estructura del oligómero Aβ pueden observarse en TEM. Las cantidades relativas y tamaño de agregados de Aβ podrían medirse por electroforesis en geles no desnaturalizantes. ELISA puede utilizarse para determinar oligómero Aβ en suero, plasma y extractos de tejido cerebral. Por último, dot Blot análisis, una técnica usada para la detección, análisis y la identificación de proteínas, podría utilizarse para evaluar la concentración relativa de oligómero Aβ en diferentes muestras con la ayuda de anticuerpos específicos de Aß y oligómero. Por otra parte, un dot Blot ensayo ofrece ahorro de tiempo significativo, como electroforesis en gel y los Blot procedimientos para los geles no son necesarios. Por lo tanto, este ensayo se usa normalmente para los inhibidores potenciales de oligómero la Aß pantalla. El objetivo general de este protocolo es describir un método relativamente simple, confiable y reproducible para preparar una muestra Aβ1-42 oligómero-ricos, para analizar las cantidades de oligómero Aβ1-42 por dot Blot análisis y oligómero de Aß de pantalla inhibidores mediante resultados experimentales semi-cuantitativos.

Protocol

1. preparación de la solución Nota: Ver Tabla de materiales para fuentes de reactivo. Preparar una solución 5% albúmina de suero bovino (BSA) mediante la adición de 5 g de BSA 100 ml de agua destilada doble. Mezclar completamente por Vortex ellos. Almacenar la solución a 4 ° C durante 1 mes. Preparar una solución anticuerpo anti-oligómero de A11 (1:1, 000) agregando 10 μl de la solución madre de anticuerpo a 10 mL de la solución de BSA de 5%. Me…

Representative Results

Para investigar si un monómero Aβ1-42 puede formar un oligómero Aβ1-42 después de la preparación, se usó análisis TEM. No agregados visibles fueron observados en la muestra de monómero disuelto HFIP Aβ1-42 (figura 1A). Por otra parte, agregados globulares principalmente con un diámetro de alrededor de 10-80 nm fueron observados en la muestra Aβ1-42 después de 48 h de agitación, lo que …

Discussion

En este protocolo hemos reportado un método para preparar las muestras que contienen oligómero Aβ1-42 y analizar las cantidades de oligómero de A11 positivo Aβ1-42 , un punto de análisis el borrar. Aunque nuestros métodos para la preparación de Aβ1-42 oligómero ricas muestras son bastante simples, fiables y reproducibles, todavía hay algunos puntos a ser notado. En primer lugar, HFIP se utiliza para disolver el péptido sintético de1-42 de Aβ. Un péptido de42…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la nacional Ciencias naturales Fundación de China (U1503223, 81673407, 21475131), el proyecto de investigación aplicada en tecnología sin fines de lucro de la provincia de Zhejiang (2016C 37110), Ningbo internacional Ciencia y tecnología Proyecto de cooperación 2014D 10019, el equipo de innovación Municipal de Ningbo del Ciencias de la vida y salud (2015C 110026), Ningbo Sci & Tech proyecto de riqueza común (2017C 50042), el Li Dak suma Yip Yio Chin Kenneth Li Marine biofarmacéutica fondo de desarrollo, y el fondo K. C. Wong Magna en la Universidad de Ningbo.

Materials

A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) Abcam GR91739-58
6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) Cell Signalling Technology 2454S
OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) Millipore AB2286
Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)  Beyotime A0208
1-42 GL Biochem 52487
1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol Aladdin I1523078
Curcumin Sigma C1386
Albumin Bovine V Solarbio A8020
Sodium chloride Sangon Biotech D920BA0003
Sodium dodecyl sulfate SCR 30166428
TRIS Solarbio T8060
Glycine Solarbio G8200
 Dimethyl sulfoxide Solarbio D8370
5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker Beyotime P0016
Genshare CFAS anyKD PAGE Genshare JC-PE022
Pure Nitrocellulose Blotting Membrane Pall Corporation T50189
Methanol SCR 10014118
Ethanol SCR 10009218
Super low range protein Marker Solarbio PR1300
Transfer Membranes Immobilon-PSQ ISEQ00010
BeyoECL Star Beyotime P0018A
Commassie Blue Fast staining solution Beyotime P0017
All – automatic chemiluminescence imaging system Tanon Tanon 5200
Image J National Institutes of Health
Image processing software Adobe Photoshop CS6
Magnetic agitator Shanghai Huxi

References

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  3. Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. Interaction of Alzheimer’s beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation. Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).
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Chunhui, H., Dilin, X., Ke, Z., Jieyi, S., Sicheng, Y., Dapeng, W., Qinwen, W., Wei, C. A11-positive β-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57592, doi:10.3791/57592 (2018).

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