用斑点印迹分析 A11-positive β淀粉样寡聚物的制备与评价
Summary
本协议描述如何从合成肽体外制备 Aβ寡聚物, 并通过斑点印迹分析来评价 Aβ的相对含量。
Abstract
β淀粉样蛋白 (Aβ) 是一种疏水性肽, 具有自组装成骨料的内在倾向。在各种团聚体中, Aβ寡聚物作为阿尔茨海默病 (ad) 进展的主要神经毒素被广泛接受, 被认为是 ad 发病的关键事件。因此, Aβ寡聚物抑制剂可以防止变性, 并有潜力发展为疾病修改治疗的 AD。然而, Aβ寡聚物的不同形成方案可能会导致不同特征的寡聚。此外, 有效筛选 Aβ1-42寡聚物抑制剂的方法也不多。A11 抗体可以与含有反平行β片结构的毒性 Aβ1-42齐聚物的子集发生反应。在本协议中, 我们描述了如何从 Aβ的合成 Aβ1-42肽的体外准备一个 A11-positive 的1-42富齐聚的样本, 并通过斑点印迹来评估样本中 A11-positive Aβ1-42齐聚物的相对数量使用 A11 和 Aβ1-42特定6E10 抗体进行分析。使用该协议, A11-positive Aβ1-42齐聚物的抑制剂也可以从半定量实验结果中筛选出来。
Introduction
阿尔茨海默病 (AD) 是影响全球老年人的最重要的神经退行性疾病之一1。普遍认为β淀粉样蛋白 (Aβ) 的异常聚集可能是 AD 的主要病理因子。Aβ骨料是老年斑块的主要成分, 是 AD 患者大脑中的生物学标志物之一。此外, Aβ聚集物, 特别是寡聚物, 产生强大的神经毒性, 这可能是导致神经元死亡的原因。因此, 抑制 Aβ寡聚物的形成可以防止变性, Aβ寡聚物抑制剂可作为 AD 的病害修饰处理。许多研究使用合成 Aβ肽在体外形成寡聚物, 探讨人工 Aβ寡聚的形貌和结构, 并利用体外模型2,3对 Aβ寡聚物的抑制剂进行研究。,4. 然而, 不同的体外形成协议的 Aβ寡聚物可能导致不同形态特征的聚类, 这可能导致不同研究组之间的不可比拟的结果。因此, 迫切需要一种标准的 Aβ齐聚物生成协议。
到目前为止, 还没有多少方法可以直接检测 Aβ寡聚物。透射电镜 (TEM)、非变性凝胶电泳、酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和斑点印迹分析可用于检测 Aβ寡聚物的数量和/或形态学体外5,6. 例如, Aβ齐聚物的形态和结构可以在 TEM 中观察到。用非变性凝胶电泳法测定 Aβ聚合的相对含量和分子量。ELISA 可用于测定血清、血浆和脑组织提取物中的 Aβ寡聚体。最后, 斑点印迹分析, 一种用于检测、分析和识别蛋白质的技术, 可用于评价不同样品中 Aβ齐聚物的相对浓度, 并借助于寡聚特异性和 Aβ特异抗体。此外, 斑点印迹检测提供了大量的时间节省, 因为凝胶电泳和印迹程序的凝胶是不需要的。因此, 这种检测通常用于筛查潜在的 Aβ寡聚物抑制剂。本协议的总体目标是描述一种相对简单、可靠且可重现的方法, 用于准备 Aβ1-42富聚物的样本, 通过斑点印迹分析来分析 Aβ1-42低聚物的数量, 并筛选 Aβ寡聚使用半定量实验结果的抑制剂。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本协议中, 我们报告了一种方法, 用于准备包含 Aβ1-42低聚物的样本, 并通过斑点印迹分析来分析 A11-positive Aβ1-42寡聚的数量。虽然我们的制备 Aβ1-42富聚物样品的方法非常简单、可靠、重现性好, 但仍有一些值得注意的点。首先, HFIP 用于溶解合成 Aβ1-42肽。聚合 Aβ1-42肽可以在 HFIP 溶液中分解成单体。但是, HFIP 容易挥发, HFIP 的粘度很低。因此, Aβ1-42</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国国家自然科学基金 (U1503223, 81673407, 21475131) 的资助, 浙江省非营利技术应用研究项目 (2016C37110), 宁波国际科技合作项目 (2014D10019)、宁波市生命科学与健康创新团队 (2015C110026)、宁波市科技 & 科技项目共同财富 (2017C50042)、李家和业杨厝港钦利海洋生物制药发展基金,宁波大学的肯塔基州金麦格纳基金。
Materials
| A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers) | Abcam | GR91739-58 | |
| 6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab) | Cell Signalling Technology | 2454S | |
| OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody) | Millipore | AB2286 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L) | Beyotime | A0208 | |
| Aβ1-42 | GL Biochem | 52487 | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol | Aladdin | I1523078 | |
| Curcumin | Sigma | C1386 | |
| Albumin Bovine V | Solarbio | A8020 | |
| Sodium chloride | Sangon Biotech | D920BA0003 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SCR | 30166428 | |
| TRIS | Solarbio | T8060 | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio | D8370 | |
| 5×nondenaturing gel PAGE Protein Marker | Beyotime | P0016 | |
| Genshare CFAS anyKD PAGE | Genshare | JC-PE022 | |
| Pure Nitrocellulose Blotting Membrane | Pall Corporation | T50189 | |
| Methanol | SCR | 10014118 | |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Super low range protein Marker | Solarbio | PR1300 | |
| Transfer Membranes | Immobilon-PSQ | ISEQ00010 | |
| BeyoECL Star | Beyotime | P0018A | |
| Commassie Blue Fast staining solution | Beyotime | P0017 | |
| All – automatic chemiluminescence imaging system | Tanon | Tanon 5200 | |
| Image J | National Institutes of Health | ||
| Image processing software | Adobe | Photoshop CS6 | |
| Magnetic agitator | Shanghai Huxi |
References
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