記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

ここで説明するすべての方法は、EU 指令 2010/63/EC 動物の福祉に準拠してイタリアの保健 (承認 (名) 860/2015-PR) 省によって承認されています。 1. 商工会議所 MEA/カスタム アセンブリの準備 注意: 起動実験前に 2 日間です。リングなし MEA を使用 (材料表を参照してください)。 きれいに MEA (期間: 35 ~ 40 分)。 酵素クリーナー パウダーを温かい蒸留水に溶解します。ブラシの MEA 表面洗浄暖かいし、MEA を浸して洗浄剤 3 h、少なくとも「暖かい。 蒸留水で十分に MEA を洗うし、糸くずのない傷のティッシュを使用してそれを乾燥します。 録音室で MEA を組み立てる (期間: 10 分 + 一晩)。 録音室の底面に弾性シール材を均等に分散します。泡がないことを確認します。 ピンセットの助けを借りて、MEA に録音室をマウントし、穏やかな圧力を適用します。任意の気泡がある場合は、円で商工会議所を移動できますわずかすべての泡が見えなくなるまで指で穏やかな圧力を適用している間。録音室の外側の境界線の周りにすべての方法シーラント層を広げます。注:重要な!シーラントと MEA の接触をカバーしていません。 MEA/商工会議所アセンブリ 15 cm シャーレ内に置きます。場所シャーレの 5 mL または 10 mL のビーカーは、MEA の近くに蒸留水を満たした。湿潤環境を維持するためにすべてをカバーします。一晩常温で治療をしましょう。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 コート親水性させる MEA (期間: 5-10 分 + 一晩)。 15 cm のシャーレに MEA を配置します。ポリ-D-リジンの 50 μ L を注ぎ MEA 記録領域に。ペトリ皿を閉じ、フィルム、シールで封印、4 ° C で一晩保管 蒸留水を使用して徹底的に MEA をリンスし、蒸留水で 4 ° C で MEA を格納します。注: プロトコルはここで一時停止することができます。コーティング測定は格納され、いくつかの実験の再利用があります。定期的にクリーニングと再コーティングの MEA ティッシュの残骸を削除し、信号対雑音比を向上させることができます。 2. ストック溶液の調製 注: 起動実験前に 1 日 (期間: ~ 2 h)。在庫ソリューションは、実験の日に実験の高速化を支援します。彼らは、事前に準備して格納できます。集中率と組成の表 1を参照してください。最終的なソリューションの構成は表 2を参照してください。 室温で蒸留水中の化学物質を溶解します。フィルターのボトルに原液をフィルター (フィルター径: 0.22 μ m)。 4 ° C でストア (推奨最大保存時間は、表 1 を参照)。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 3. 寒天培地の調製 注: 起動実験前に 1 日 (期間: ~ 1 h)。 250 mL の蒸留水を 500 mL のビーカーに注ぐし、350 rpm で攪拌を開始します。寒天 5 g を追加し、それを完全に溶解するまで待機します。 熱 250-300 ° C でソリューションソリューションが 2.5 %w/v 寒天液を屈する 〜 200 mL になるまで蒸発水をしましょう。注: 温度が十分に高い水が泡立ち無し蒸発させるはずです。 Cm 高壁 ~1.5 の 200 mL プラスチック正方形のボックスの上に寒天液を注ぎ、冷まします室温で固体になるまで。 ボックスをカバーし、4 ° C で保管寒天培地のブロックは、数週間のために良いです。注: プロトコルはここで一時停止することができます。 4. 凍結面の準備 注: は、実験前に 1 日を開始します。 0.5 – 1 cm 縁下まで蒸留水でフラット底ステンレス ボウルを埋めます。 一晩-20 ° C で保存します。 5. 神経切断アプライドの準備 注: 起動実験前に 1 日または実験の同日 (表 1と表 2を参照) (期間: 30 分)。 500 mL ビーカーに蒸留水 200 mL を注ぎ、350 rpm で磁性攪拌器を使用して攪拌を開始します。 ストック B の 50 mL と 50 mL の在庫 C の追加 (表 1参照)。 1 mM L-アスコルビン酸、D-グルコース 10 mM 208 mM ショ糖 3 mM ピルビン酸を追加します。注: ピルビン酸の実際の量は密度や純度に依存し、バッチによって異なる場合があります。常に新しいバッチを開くときに必要量を計算します。 フィルム シール カバーし、30 分間攪拌させます。 500 mL のメスフラスコに溶液を移し、フラスコに蒸留水を追加します。 フィルム シールと容積測定フラスコを密封し、優しくの反転 3 – 5 回ソリューションが均等にクリアされるまで。 キャップをガラス瓶の中に切断アプライドを転送します。 4 ° C まで冷却するため、切削アプライド-80 ° C、20-30 分または 4 ° C で一晩を格納します。注: プロトコルを一時停止できるここで一晩冷却が好ましい場合。それ以外の場合所要時間冷却切削アプライドを使用して手順 6 を追求する可能性があります。 6. 開催の準備アプライド 注: 準備ソリューション新鮮な実験の日 (期間: 5-10 分)。アプライドはスライスのプロシージャの間に切削アプライドから脳スライスをすすぎに使用する保持 (手順 8.16 参照) と脳スライスの長期的なストレージおよび温暖化済み。脳スライスをすすぎにアプライドの 100 mL で十分です。このプロトコルで使用される保持および事前地球温暖化の部屋は、カスタムメイドされそれぞれ 300 mL と 100 mL の量が含まれて (参考: 図 1 a)。この設定では、アプライドの 500 mLで十分です。商業ソースから得られたチャンバー ケース開催準備するアプライドの全体量を調整する必要があります別のボリュームがあります。 500 mL のメスフラスコに蒸留水 200 mL を注ぐ。 1 mM L アスコルビン酸株式 M、6.5 mL、50 mL のストック B の株式 A の 50 mL を追加します。振とう L-アスコルビン酸を完全に溶解するまで、回転の動きを使用して。 最終巻に到達、フィルム、シールとシールの容積測定フラスコに蒸留水を追加し、そっとの反転 3 – 5 回ソリューションが均等にクリアされるまで。持株アプライド組成は表 2を参照してください。 7. 実験ベンチの準備 注: これは 15 分プラス 30 分暖かい浴室の安定した温度を取得する必要があります。 記録ベンチ 温かいお風呂を開始、32 ° C に設定して、その温度を維持するためにそれをカバーします。注: このプロトコルで使われる温かいお風呂は、カスタムメイド ハード プラスチック製のボックスと所望の温度で設定済み水槽サーモスタットを使用することができます。安定した温度は、室温から始まって ~ 30 分で達して可能性があります。前地球温暖化とインキュベーターのチャンバーは、プラスチック製のボックスの下部に座っている、ので水位はする必要があります浮動小数点から部屋を保つためにサーモスタットをまかなうに足るだけ。 開催と事前地球温暖化室 (参考: 図 1 a)、組み立てるし、それらにアプライドの持株を注ぐ。室温で保持チャンバーを維持し、事前地球温暖化室内の温かいお風呂を配置します。バブル 95% O25% CO2ガス混合ソリューションを開始し、反転パスツール ピペットを使用して任意の閉じ込められた気泡を削除します。覆われて保ちます。 ベンチと vibratome スライス シアノアクリ レート系接着剤を使用して試料ディスクの中央に小さな寒天ブロックを接着します。 氷のバケツに 250 mL のビーカーを置くし、アプライドに食い込んでそれを注ぐ。 2 つの 100 mL ビーカーを取るし、それぞれにアプライドの 50 mL を注ぐ。室温でビーカーを残します。すすぎのビーカーです。 バブル 95% O25% CO2ガス混合ソリューションを開始します。 Vibratome にバッファー トレイをマウントし、砕いた氷とそれを囲みます。スライス処理中に低温を維持するために支援するために砕いた氷をいくつかエタノールを注ぐ。注ぐエタノール後必要に応じてより多くの氷を追加します。注: 2 ° C の温度が最適です。 バッファー トレイ内バブラーを配置し、組み立てる vibratome ブレード ブロックをマウントします。注: クリアランス ~ 10 ° の角度でブレードがマウントされていることを確認します。 ボリュームと蒸留水と塗りの 2/3 に 500 mL ビーカーに砕いた氷を設置します。 冷凍庫から冷凍のボールを取り、スライスのベンチに逆さまに配置、紙タオル、ろ紙ディスクでそれをカバーします。 麻酔ベンチ 氷で満たされたトレイに小さなボウルを配置し、アプライドをカットを注ぐ。95% O25% CO2ガス混合物でバブルを開始します。 8. 脳スライス標本とメンテナンス 注: このプロトコル利用大人 (4 – 6 週齢) の男性 CD1 マウスが他の系統 (例えばc57/bl617,18) を使用できます。我々 はまた後でと同じ年齢の男性の Sprague-dawley ラットから得られた脳スライスによって得られたマウス脳切片を用いて実験の出力を比較します。次の手順は、CA3 駆動高速間欠期のような活動が適切な海馬が拘束され、として海馬傍皮質に伝達できない脳スライス部分的切断の準備を参照してください。23で説明します。海馬-皮質の切断は、海馬 EC 脳スライス標本を用いた電気変調研究を追求する前提です。使用 vibratome は、材料表に記載されているモデルです。他のモデルは、別のプロシージャを必要があります。 イソフルランの使用齧歯動物を麻酔 5%、カーボゲン ・ ガス混合物 2 L/分で麻酔誘導室に配信。 深麻酔下 (足への応答と足反射ピンチ)、23のように標準的な手順 1 min 以内で脳を抽出します。釣合い冷たい切削アプライドを含む小さなボウルに脳を置き、90-120 秒冷やします。注: が長すぎるためチル脳をさせない、それがフリーズするそれ以外の場合。 バッファー トレイに冷たい切断アプライドを注ぐ。フィルター紙の上に広がる切削アプライドは冷凍のボウルに配置されます。フィルター紙の上に脳を置き、小脳を取り外して、まっすぐ正面ポールを切る必要な脳組織ブロックを分離します。 曲がったへらの助けを借りて、カット前頭面寒天ブロックと vibratome 刃に直面して後頭極にして試料ディスク上に脳の背側を接着します。シアノアクリ レート系接着剤の薄層を使用します。すぐにバッファー トレイに試料ディスクを置き、固定します。 寒天ブロックまで組織横断 vibratome ブレードを移動するために断面範囲を調整します。脳組織ブロックとブレードのレベルに到達する試料ディスク高さを調整します。 海馬がはっきり表示されるまでティッシュ セクションを破棄 (通常 ~ 900 μ m)。400 μ m のスライス厚を設定し、組織切片を保持するスライスを開始します。各脳のセクションの 2 つの半球を分割し、2 つの脳のスライスを取得する不要な組織をトリムします。バッファー トレイはその後のセクションの中に高まって、アイスの蒸留水でバッファー トレイ拠点を埋める (7.2.7 の手順を参照してください)。 軽く最初の洗浄のビーカーで脳スライスを転送、パスツール ピペットを空にして脳スライスを 2 回目のすすぎのビーカーに転送反転パスツール ピペットを使用します。保持室に脳スライスを転送し、少なくとも 60 分回復させます。注: 通常 6-8 脳スライス全体を取得することが可能です。プロトコルはここで一時停止する可能性があります。 9. 4 AP (4AP アプライド) を含むアプライドの準備 注: これは、準備のため 10 分プラス 20 分地球温暖化の必要があります。注意!4 AP は痙攣の薬、それは有毒であります。手袋をはめて処理し、こぼれます。 500 mL のメスフラスコに蒸留水 200 mL を注ぐ。 1 mM L アスコルビン酸株式 M、5 mL、50 mL のストック B の株式 A の 50 mL を追加します。振とう L-アスコルビン酸を完全に溶解するまで、回転の動きを使用して。 4AP 在庫の 500 μ L を追加します。 最終巻に到達、フィルム、シールとシールの容積測定フラスコに蒸留水を追加し、ソリューションが均等にクリアされるまでを優しくそれに 3-5 回を反転します。 (参考: 図 1 a) 4AP インキュベーターのチャンバーを組み立てるし、4AP アプライドの ~ 80 mL を注ぐ。商工会議所をカバー、温かいお風呂にそれを転送し、95% O25% CO2ガスの混合物でバブリングを開始します。反転パスツール ピペットを使用して任意の閉じ込められた気泡を削除します。覆われて保ちます。 4AP アプライド温度は 30-32 ° C (~ 20 分) まで待機します。注: プロトコル可能性がある場合に一時停止ここ脳スライスはまだ回復します。 10. 事前地球温暖化と 4AP のスライスの孵化 (期間: 90 分) 事前に地球温暖化のアプライド ・ 4AP アプライド温度が 30-32 ° c. であることを確認します。 逆ガラス パスツール ピペットを使用して事前地球温暖化室に 1 脳スライスを転送し、25-30 分間組織休ませて。4AP アプライドのインキュベーター室に脳スライスを転送し、60 分間安静にしましょう。 11. MEA セットアップの準備 注: は、録音の前に 15 分を開始します。 4AP アプライドの残りの量を 500 mL の三角フラスコに転送します。 MEA アンプの上の棚に三角フラスコを置き、60 mL の注射器を連続的に給紙するソリューションを許可するようにチューブを使用します。三角フラスコと 1 mL/分の重力供給率を許可するように注射器の高さを調整します。注: 適切な高さは、チューブ内径 (ID) に依存します。5/32 インチ ID のチューブ、30 cm あれば十分です。 バブル 4AP アプライド エルレンマイヤー フラスコと 95% O25% CO2ガス混合物で注射器を起動します。 そこまでビーカーに灌流管を通して聞かせて 4AP アプライド流れは内部; 空気がないです。ソリューション フローを停止します。 MEA の基地で加熱要素をサーモスタットに接続します。MEA アンプ内部乾燥の MEA チップを置き、アンプ ヘッドを保護します。プラスチックのパスツール ピペットを使用して 4AP アプライドを入口と録音室の外側の貯水池に転送。 マグネット ホルダーに暖房カニューレをセキュリティで保護し、記録室入口ポート内にその先端を配置MEA アンプ ヘッド; の磁気ストライプに磁気ホルダーを取り付けますカニューレ; に灌流管を接続します。カニューレをサーモスタットに接続します。注: 加熱カニューレは、傾斜したポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) チューブ記録室入口ポートに到達してカニューレの金属材料によるノイズを最小限に抑えることによってカバーされなければなりません。インレット タンクが十分に 4AP アプライドでいっぱいになる、灌流システムから落ちる水滴は表示しないでください。 貯水池内吸引針を置き、アプライド; に吸引針を水没によって否定的な圧力があることを確認一定の低周波吸引音を確認します。注: 吸引針は脳スライス面の直上流に 4AP アプライドを許可するように置かれるべき。低騒音真空ポンプや真空ラインに使用できます。 1 mL/min の流速にでき始める灌流量制御を設定します。注: 重力供給の灌流は、蠕動ポンプによって引き起こされるかもしれないノイズを除去します。蠕動ポンプが好まれる低雑音モデルは必須です。 4AP アプライド、カニューレを流れる、一度サーモスタットを入れます。37 ° C および MEA ベース録音チャンバ内 32-34 ° C の温度を達成するために 32 ° c に加熱カニューレを設定します。注:注意!決して熱またはそれのソリューションなしカニューレが不可逆的破損があります。カニューレの固有温度オフセット設定値と記録室内暖房カニューレの先端では実際の値との間に記録温度 (すなわち32-34 ° C) よりも高い温度を設定します。流量、温度、環境、録音時の音量は部屋すべて影響記録ソリューションの温度です。11.9 の手順で報告された設定は、記述されているプロトコルおよび装置に最適です。常に熱電対を使用して実際の録音の温度をチェックし、必要に応じて設定を調整します。脳スライスの過熱を避けるために 34 ° C の上の MEA ベースを加熱しないでください。 記録室入口貯水池に外部参照電極を配置します。注: 内部参照電極を用いた MEA チップが装備されていますが、これはカスタム記録室にカバーされます。したがって、外部参照電極を使用する必要があります。塩素処理を必要とせず使用する準備ができたので、飽和 KCl ペレットは最も実用的です。 12. MEA ライブ マッピング 一度 4AP アプライド レベルおよび記録温度が安定、必要ターンとして、血流と一時的にそれらを停止するオフの位置に吸引の活栓。 逆ガラス パスツール ピペットを用いた MEA 記録室に 1 つの脳のスライスをすばやく転送します。ファイアーポリッシュ カール パスツール ピペット (図 1) または柔らかいコンパクトな小さなブラシを使用して必要な MEA の記録領域の位置を調整します。脳スライスにホールド アンカー (図 1) を配置します。位置に戻って、活栓を回すことによって、血流と吸引を再起動します。注:重要な!スライスを転送する必要がありますと 60 以内に、灌流を再起動 s や組織が死ぬことがあります。脳スライスが表面張力の違いによる脳スライスにアンカーを配置しながら移動するを防ぐために 4AP アプライドでスライス ホールド アンカーしておきます。MEA に脳スライスを確保するためアンカー ステンレス鋼ワイヤーとナイロン スレッド (図 1) を使用してカスタムすることができます。 または商業源から得られます。MEA チップを最終的な実験の設定はアンプのヘッドに接続図 1Eショー: カスタム アンカー記録室内 MEA チップで休んで脳スライスを押した。出口貯水池内吸引針 (青い矢印) の配置に対し、基準電極 (赤い円) と暖房カニューレ (赤矢印) をカバー チューブ PTFE は入口貯水池に配置されます。 倒立顕微鏡ステージ上に設置されたカメラを使用して脳スライスの写真を撮る。 電極をマップする GUI を開始するコンピュータ ・ ソフトウェアのスクリプトmapMEAを実行します。注: カスタムメイドのソフトウェアは、脳スライスの特定の構造に対応する電極を選択するユーザーをことができます。この手順は、正しい経路をアクティブにし、電気刺激による発作活動を抑制することが重要です。 図 2: のための GUI のライブMEA 電極マッピング。(A) MEA に配置されている結合された海馬 EC スライスの模式図。このプロトコルで使用される既定の構造は、コルニュ ammonis 3 (CA3) enthorinal 皮質 (EC)、嗅周囲皮質 (PC) と subiculum (サブ)。参照電極は三角記号のマーカーとして描き出しました。点線で囲まれた電極は、イメージの矯正の XY 座標を表しています。(B) 画面は、GUI のライブの MEA マッピング中にキャプチャします。キャプチャの左のフロー チャートは、ステップバイ ステップの手順を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 脳スライスの画像をロードする [参照] ボタンをクリックします。参照電極が (図 2 a、三角形マーク) MEA の左半分側の上の行に表示されることを確認します。ポインターをアクティブにするボタンをクリックし、イメージを矯正と電極マッピングの XY 座標をマークする配列の左端の行の上部と下部の電極を選択します。 スライスの種類ドロップ ダウン メニューから選択、水平にします。既定の構造をチェックします。注:新しい構造の入力ボタンを選択して、構造をカスタマイズすることが可能です。水平脳スライスの既定の構造は、図 2 aに描かれています。 脳スライスの写真の下の番号の押ボタンを使用して、投資収益率に対応する電極を選択し、割り当てる (図 2 b); 構造パネルの対応するボタンをクリックしてくださいそれぞれの投資収益率のためには、この手順を繰り返します。 保存ボタンを押す: ソフトウェアは、選択した電極や Roi レポート テーブルを含む#EXP_LabelledElectrodesをという名前の結果フォルダーを生成します。 13 てんかん活動記録と電気変調 録音の前に 5-10 分の記録チャンバー内を安定させるために脳のスライスを許可します。 自己校正と安定化させる刺激プロトコルの前に刺激の単位、少なくとも 10 分を入れます。刺激制御ソフトウェアを起動し、刺激および MEA アンプは正常に接続されている刺激制御ソフトウェアのメイン パネルの緑の LED によって示されることを確認します。特定の楽器や材料表を参照の追加の詳細については、ソフトウェアのマニュアルを参照してください。 バイポーラで刺激を設定します。(Cf.セクション 12) スクリプトmapMEAにマップされているものの中で CA1/近位の subiculum (参考:24,25) の錐体細胞層との接触電極のペアを選択します。選択した電極の一つを刺激と同じ刺激装置チャネルの肯定的なプラグに他の電極の負のプラグに接続するのにワイヤを使用します。アンプのアース線を刺激の地面を接続別のワイヤを使用します。 レコーディング ソフトウェアを起動します。データを取得するには、記録ソフトウェアのメイン パネルで再生ボタンを押します。レコードの少なくとも 4 発作放電。注: 2 kHz のサンプリング周波数では、ハード ディスク領域の使用量を最小限に抑えながら公正な解決と電位を獲得ことができます。5 分記録ファイルは、〜 80 MB を取ります。高いサンプリング周波数が必要など、レコード刺激アイテムまたはマルチ ユニットの活動に。フィールド電位のみを観察するには、マルチ ユニットの活動を遮断する 300 Hz でライブのローパス フィルターを使用します。 刺激強度を決定します。 刺激コントロール ソフトウェアのメイン ・ パネルを使用して、正方形の相性正・負現在パルス持続時間 100 μ s/相をデザインします。注:注意!直流刺激は、機器の損傷を避けるためにバランスの取れた充電パルスを必要とします。 最高の刺激強度を識別するために高速な入力/出力 (I/O) テストを実行します。5 のパルス間間隔を追加することによって手順 13.5.1 0.2 Hz 以下で設計されている刺激パルスを配信 s 以上刺激制御ソフトウェアの適切なフォームで。パルス振幅] タブで入力 100 μ A/相の初期パルス振幅と刺激は確実に海馬傍皮質の発作間欠期のようなイベントを呼び起こすことができるまでの各裁判で 50-100 μ A ステップを増やす (可視化された信号をチェック、レコーディング ソフトウェア) です。 大脳辺縁系発作原性の電気変調 プログラムの利益の刺激のプロトコルを提供する刺激のユニット。I/O テスト中に識別される刺激の振幅を使用します。注: 換起された応答の故障率は、引時間: 20% をする必要があります。 刺激を止めて後、は、(ステップ 13.4) のように、少なくとも 4 発作放電を記録することによって前刺激条件にネットワークの回復を確認します。