Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Gabriella Panuccio; Ilaria Colombi; Michela Chiappalone

doi:10.3791/57548

JoVE Journal > Neuroscience

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Neuroscience

Enregistrement et Modulation de l’activité épileptiforme dans des tranches de cerveau rongeur couplé aux baies de microélectrodes

Published: May 15, 2018

doi:

10.3791/57548

Gabriella Panuccio¹, Ilaria Colombi¹, Michela Chiappalone^1,2

¹Department of Neuroscience and Brain Technologies,Istituto Italiano di Tecnologia, ²Rehab Technologies,Istituto Italiano di Tecnologia

Summary

Nous illustrons comment effectuer une modulation électrique et d’enregistrement de l’activité épileptiforme induite par la 4-aminopyridine dans des tranches de cerveau de rongeurs à l’aide de matrices de microélectrodes. Une chambre d’enregistrement personnalisé maintient le tissu viabilité tout au long des sessions expérimentales prolongées. Cartographie de l’électrode en direct et sélection des paires stimulants sont effectuées par une interface utilisateur graphique personnalisée.

Abstract

Épilepsie du lobe temporal (TLE) est le plus commun partiel syndrome épileptique complex et la moins sensible aux médicaments. Stimulation cérébrale profonde (SCP) est une approche prometteuse lors de traitement pharmacologique échoue ou la neurochirurgie n’est pas recommandé. Tranches de cerveau aiguë associées aux baies de la microélectrode (AME) représentent un outil précieux pour étudier les interactions de réseau neuronal et leur modulation par stimulation électrique. Par rapport aux techniques conventionnelles d’enregistrement extracellulaire, elles offrent l’avantage supplémentaire d’un plus grand nombre de points d’observation et une distance inter électrode connue permettant d’étudier le trajet de propagation et vitesse d’électrophysiologiques les signaux. Cependant, oxygénation des tissus peut être grandement altérée au cours de la MEA, enregistrement, nécessitant un taux de perfusion élevé, ce qui se fait au prix d’une diminution de ratio signal-bruit et oscillations plus élevées de la température expérimentale. Stimulation électrique encore souligne le tissu cérébral, rendant difficile de poursuivre des époques d’enregistrement/stimulation prolongée. En outre, modulation électrique de l’activité cérébrale tranche doit cibler les ouvrages d’art/voies spécifiques au sein de la tranche de cerveau, exigeant que la cartographie électrode être facilement et rapidement jouée en direct pendant l’expérience. Ici, nous illustrons comment effectuer la modulation électrique et d’enregistrement de la 4-aminopyridine (4AP)-induite par l’activité épileptiforme dans des tranches de cerveau rongeurs à l’aide d’ame plane. Nous montrons que le tissu cérébral provenant de souris surpasse le tissu de cerveau de rat et ce qui est mieux adapté aux expériences MEA. Ce protocole garantit la génération et l’entretien d’un modèle stable épileptiforme qui fidèlement reproduit les caractéristiques électrophysiologiques observées avec enregistrement potentiel champ conventionnel, persiste pendant plusieurs heures et survit soutenue stimulation électrique pour les époques prolongées. Viabilité des tissus tout au long de l’expérience est réalisée grâce à l’utilisation d’une chambre d’enregistrement personnalisé petit volume permettant des taux de perfusion à flux laminaire et l’échange de solution rapide même à faible (1 mL/min). La cartographie MEA rapide pour surveiller en temps réel et le choix des électrodes de stimulation est réalisée grâce à une interface utilisateur graphique personnalisée (GUI).

Introduction

L’épilepsie est une affection progressive mortelle provoquant l’activité incontrôlée du cerveau¹; elle porte entre le fardeau le plus élevé de la maladie et la stigmatisation sociale importante²^,³. TLE est le syndrome plus fréquent (40 %) et le plus fréquemment (~ 30 %) résistant aux médicaments antiépileptiques⁴. Alors que l’ablation chirurgicale du tissu épileptogène peut améliorer l’état du patient, il n’est pas possible chez tous les patients et ne peut garantir une vie totalement libérée de la saisie de⁵. Modulation des épileptiques réseaux limbiques par DBS électrique est une approche prometteuse lors de traitement pharmacologique ou neurochirurgie ne conviennent pas.

Coupes de cerveau de rongeurs constituent un outil précieux pour étudier comment neuronale fonction de réseaux en santé et la maladie⁶ au moyen de in vitro techniques d’électrophysiologie, qu’ils conservent, au moins en partie, l’architecture originale et la connectivité du cerveau région (s) d’intérêt (ROI). En particulier, horizontal combiné hippocampe-entorhinal cortex (hippocampe-EC) tranches comprennent les réseaux de neurones essentiels impliqués dans le TLE et sont donc systématiquement employées dans in vitro TLE recherche⁷.

Saisie-comme l’activité peut être aiguë induite dans des tranches de cerveau en changeant la composition ionique du fluide céphalo-rachidien artificiel (ACSF), tels que la baisse de magnésium tout en augmentant le potassium⁸^,⁹^,¹⁰, ou Grâce à des manipulations pharmacologiques, comme le blocage de l’activité GABAergique inhibitrice (voir¹¹ pour un examen complet). Cependant, ces modèles sont basés sur l’altération déséquilibrée de l’excitation et l’inhibition ; ainsi, ils ne permettent pas étudier l’interaction et la contribution concertée des réseaux excitatrices et inhibitrices d’ictogenèse. Perfusion continue des tranches de cerveau avec la drogue convulsivante 4AP améliore la neurotransmission excitatrice et inhibitrice, ce qui permet d’étudier l’ictogenèse aiguë tout en gardant l’activité synaptique globalement intacte¹².

AME permettre d’enregistrer l’activité électrique générée par réseaux de neurones d’un plus grand nombre de points d’observation par rapport aux classiques domaine extracellulaire de l’enregistrement potentiel, où les restrictions spatiales limitent le nombre d’électrodes qui peuvent être logés sur la surface de tranches de cerveau. En outre, MEA puces offrent l’avantage de la distance inter électrode connue, qui est très utile à la propagation de trace et évaluer la vitesse de déplacement des signaux enregistrés. Bien qu’initialement conçu pour l’enregistrement de neurones en culture¹³^,¹⁴, Ame servent également à caractériser les caractéristiques électrophysiologiques des tranches de cerveau aiguë provenant de rongeurs¹⁵ et les humains¹⁶. Ainsi, dans le cadre de la recherche sur l’épilepsie, Ame représente un outil précieux pour identifier les interactions des réseaux de neurones au cœur du ictogenèse¹⁶^,¹⁷^,¹⁸.

Cependant, enregistrement de MEA porte intrinsèquement des difficultés techniques à obtenir ou à maintenir un modèle épileptiforme stable tout au long des protocoles expérimentaux long (plusieurs heures). Tout d’abord, oxygénation des tissus ne peut pas suffire au sein de la grande et ronde submergé de type enregistrement chambre¹⁹^,²⁰ typique des AME disponible dans le commerce, alors que le mauvais rapport signal-bruit et l’instabilité de la température pouvant affecter la qualité de l’enregistrement lorsqu’un taux de perfusion élevé (6 à 10 mL/min) est utilisée pour améliorer l’apport d’oxygène à la tranche de cerveau (voir, par exemple, les notes techniques, le chauffage et la perfusion équipement²¹). Deuxièmement, récurrentes des rejets comportant des composants haute fréquence, tels que les décharges épileptiformes, on observe guère lors de l’utilisation immergée de type enregistrement chambres¹⁹; C’est particulièrement le cas lorsque le modèle épileptiforme aiguë est induit chimiquement et implique des mécanismes ephaptic, comme c’est le cas pour la 4AP modèle²² (voir¹¹ pour une vue d’ensemble). Pour surmonter ces limites, plusieurs stratégies ont été proposées par les chercheurs. Par exemple, augmenter le taux de perfusion¹⁹^,²⁰ tout en réduisant l’épaisseur de tranche de cerveau (≤300 µM) et de la zone¹⁷^,,¹⁸ est des facteurs essentiels à la réalisation de l’alimentation en oxygène suffisant au tissu. En outre, cerveau amélioré la viabilité tranche également être possible en utilisant ame perforé (pMEAs), qui permettent perfusant le tissu de cerveau entre les deux côtés¹⁸.

Considérant que les approches décrites ont considérablement amélioré la possibilité d’enregistrement de la MEA de tranches de cerveau, ils n’ont pas été testés contre prolongée (plusieurs heures) des séances de stimulation électrique et d’enregistrement, ce dernier représentant une importante stress pour le tissu cérébral. Sessions d’enregistrement prolongée peuvent être nécessaire pour étudier l’évolution dans le temps des caractéristiques des modèles épileptiforme qui ne serait pas possibles de démasquer par des mesures à court terme. Dans le cadre de la recherche DBS, il faudra des protocoles expérimentaux prolongées pour évaluer et comparer les effets de plusieurs paradigmes de stimulation dans la même tranche de cerveau.

Lorsque seule l’activité électrique spontanée doit être enregistré, cartographie des électrodes en ce qui concerne le retour sur investissement se fait généralement a posteriori, c’est-à-direau cours de l’analyse des données ; au lieu de cela, l’étude des réponses évoquées ou des paradigmes de neuromodulation électrique nécessite que stimulation livrés à des ROI(s) spécifiques, dicter la nécessité de la cartographie d’électrode direct simple et rapide pendant l’expérience.

Ici, nous illustrons un simple protocole expérimental qui permet pour l’induction et le maintien d’un modèle stable épileptiforme induite par la 4AP dans des tranches de cerveau de rongeurs adultes. L’activité observée reproduit fidèlement les caractéristiques électrophysiologiques de ce modèle caractérisée en utilisant des techniques d’électrophysiologie extracellulaire classiques. Il persiste pendant plusieurs heures et survit à une stimulation électrique soutenue pour les époques prolongées répétées. Les chambres utilisées pour entretenir et incuber les tranches de cerveau peuvent être facilement assemblés à l’aide de fournitures de laboratoire standard (Figure 1 a), alors qu’une chambre d’enregistrement personnalisé permettant des taux de change de solution optimale et à flux laminaire (Figure 1 b) peut provenir de sources commerciales ou à l’aide de la technologie d’impression 3D à un prix abordable. Cartographie rapide de la ROI(s) pour la surveillance en temps réel et pour le choix des électrodes de stimulation est rendue possible par une interface utilisateur conviviale personnalisée, nommée mapMEA, disponible gratuitement sur demande.

Figure 1 : équipement personnalisé utilisé pour ce protocole. (A) la tenue chambers pour la restauration, préchauffage et pré-incubation dans 4AP sont assemblés à l’aide d’un gobelet et une boîte de Pétri. La boîte de Pétri devrait être plus petit diamètre que le disjoncteur et est maintenu en place au moyen d’un piston de la seringue. Le bas de la boîte de Pétri est remplacé par une maille en nylon (à partir de douces bas) collée à la cyano sur le rebord de la boîte de Pétri. L’oxygène est assurée par une aiguille de la colonne vertébrale tordue (22 G), insérée entre les murs de la boîte de Pétri et le bécher. Bulles devraient se dégager du côté du bécher et jamais portée les mailles de nylon afin d’éviter le déplacement de tranches de cerveau. La partie supérieure d’une boîte de Pétri peut servir comme un couvercle pour éviter l’évaporation de l’ACSF et maintenir la saturation en oxygène. (B) enregistrement personnalisé chambre. dans : réservoir d’entrée pour accueillir la canule de chauffage et de l’électrode de référence. out : réservoir de prise pour accueillir l’aiguille d’aspiration. chambre de Rec : enregistrement. Pipette Pasteur de verre (C), courbé par le feu-polissage, utilisée pour traiter le tissu et ajuster sa position au sein de la chambre d’enregistrement. Ancre de fixation (D) Custom tranche. Le montage Final (E) de la chambre d’enregistrement monté sur la puce de la MEA. Une tranche de cerveau repose sur la partie inférieure, maintenue en place par l’ancre. La flèche rouge indique le tube PTFE couvrant la canule de chauffage, tandis que le cercle rouge indique l’électrode de référence, une boulette de KCl saturée submergée par le FSCA dans le réservoir d’aspiration. La flèche bleue indique l’aiguille d’aspiration dans le réservoir de sortie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le ministère italien de la santé (autorisation n. 860/2015-PR) en conformité avec la directive UE 2010/63/EC sur le bien-être animal. 1. préparation de l’Assemblée de la chambre MEA/Custom Note : Commencer 2 jours avant l’expérience. Utiliser un MEA sans anneau (voir Table des matières). Nettoyer le MEA (durée : 35 à 40 min). Faites dissoudre un nettoyant enzymatique en poudre dans l’eau distillée chaude. La chaude nettoyant sur la surface de la MEA, puis trempez la MEA dans le chaleureux nettoyage solution pendant au moins 3 h. Rincez la MEA abondamment à l’eau distillée et séchez-le à l’aide d’un chiffon non pelucheux griffes. Assembler la MEA avec la chambre d’enregistrement (durée : 10 min + une nuit). Étendre uniformément le produit d’étanchéité en élastomère sur la surface inférieure de la chambre d’enregistrement. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles. Monter la chambre d’enregistrement sur la MEA à l’aide de la pince à épiler et appliquez une légère pression. Si il n’y a aucune bulles, déplacer légèrement la chambre dans un cercle tout en appliquant une légère pression avec les doigts jusqu’à ce que toutes les bulles ont disparu. Étaler une couche de scellant tout autour du bord extérieur de la chambre d’enregistrement.Remarque : critique ! Ne pas couvrir les contacts MEA avec le mastic. Placer l’ensemble de la MEA/la chambre à l’intérieur d’une boîte de Pétri de 15 cm. Place un plat de Pétri de 5 mL ou un bécher de 10 mL remplie d’eau distillée à proximité de la MEA. Couvrir tout pour maintenir un environnement humide. Laisser guérir à température ambiante pendant la nuit.Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Enduire la MEA pour le rendre hydrophile (durée : 5-10 min + une nuit). Placez la MEA dans une boîte de Pétri de 15 cm. Verser 50 µL de poly-D-lysine sur la zone d’enregistrement de MEA. Fermez la boîte de Pétri, fermez-le hermétiquement avec film d’étanchéité et stocker pendant la nuit à 4 ° C. Rincez la MEA soigneusement avec l’eau distillée et stocker la MEA à 4 ° C dans l’eau distillée.Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. MEAs enduits peuvent être stockés et réutilisés pour plusieurs expériences. Régulièrement nettoyage et re-enduit la MEA aide à enlever les débris tissulaires et améliorer le rapport signal-sur-bruit. 2. préparation des Solutions mères Note : Commençant 1 jour avant l’expérience (durée : environ 2 h). Solutions mères aident à accélérer l’expérience ce jour-là expérimentale. Elles peuvent être préparées à l’avance et stockés. Voir le tableau 1 pour la composition et le facteur de concentration. Voir tableau 2 pour la composition des solutions finales. Dissoudre les substances chimiques dans l’eau distillée à température ambiante. Filtrer les solutions mères avec un filtre de bouteille (diamètre du filtre : 0,22 µm). Conserver à 4 ° C (voir le tableau 1 pour les durées de conservation maximales recommandées).Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. 3. préparation de la gélose Note : Commençant 1 jour avant l’expérience (durée : environ 1 h). Verser 250 mL d’eau distillée dans un bécher de 500 mL et commencer à agiter à 350 tr/min. Ajouter 5 g d’agar et attendez qu’il soit complètement dissous. Chauffer la solution à 250-300 ° C. Laissez l’eau s’évaporer jusqu’à ce que la solution soit ~ 200 mL pour obtenir une solution d’agar 2,5 % w/v.Remarque : La température doit être suffisamment élevée pour laisser l’eau s’évaporer sans formation de bulles. Verser la solution d’agar sur une boîte carrée en plastique de 200 mL de ~1.5 cm de haut murs et laissez-le refroidir à température ambiante jusqu’à ce qu’il devienne solide. Couvrir la boîte et rangez-la à 4 ° C. Le bloc d’agar est bon pour plusieurs semaines.Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. 4. préparation de l’avion congelée Note : Commençant 1 jour avant l’expérience. Remplir un bol en acier inoxydable fond plat avec de l’eau distillée jusqu’à 0,5 – 1 cm du bord. Conserver à-20 ° C durant la nuit. 5. préparation des neuroprotecteurs coupe FSCA Note : Commençant 1 jour avant l’expérience ou le jour même de l’expérience (voir tableau 1 et tableau 2) (durée : 30 min). Versez 200 mL d’eau distillée dans un bécher de 500 mL et commencer à agiter avec un agitateur magnétique à 350 tr/min. Ajouter 50 mL de stock B et 50 mL de stock C (voir tableau 1). Ajouter 3 mM l’acide pyruvique, saccharose 208 mM, 10 mM D-glucose et 1 mM L-ascorbique acide.Remarque : Le volume réel de l’acide pyruvique dépend de la densité et de la pureté et peut varier en fonction du lot. Toujours calculer le volume requis lors de l’ouverture d’un nouveau lot. Couvrir avec film d’étanchéité et laisser remuer pendant 30 min. Transvaser la solution dans une fiole jaugée de 500 mL et ajouter de l’eau distillée pour remplir la fiole. Sceller la fiole jaugée avec film d’étanchéité et retourner doucement à 3 – 5 fois jusqu’à ce que la solution soit uniformément claire. Transvaser la coupe FSCA dans une bouteille en verre avec bouchon. Stocker la coupe FSCA à-80 ° C pendant 20-30 min ou à 4 ° C durant la nuit pour refroidir à 4 ° C.Remarque : Le protocole peut être suspendu ici si le refroidissement du jour au lendemain est préféré. Sinon le temps requis pour la coupe FSCA de refroidissement peut être utilisée pour poursuivre l’étape 6. 6. préparation de l’exploitation FSCA Remarque : Préparer la solution fraîche le jour de l’expérience (durée : 5-10 min). La tenue ACSF servira à rincer les tranches de cerveau de la découpe FSCA pendant la procédure de découpage en tranches (voir étape 8.16) et pour le stockage à long terme de cerveau tranche et préchauffage. Pour rincer les tranches de cerveau, 100 mL de tenir l’ACSF est suffisante. Les chambres tenant et préchauffage utilisées dans le présent protocole sont faits sur mesure et contiennent un volume de 300 mL et 100 mL, respectivement (voir Figure 1 a). Avec ce réglage, 500 mL de tenir l’ACSF est suffisante. Chambers a obtenu de sources commerciales peuvent contenir un volume différent, dans lequel cas le montant global de holding FSCA pour être préparé doit être ajustée en conséquence. Versez 200 mL d’eau distillée dans une fiole jaugée de 500 mL. Ajouter 50 mL de stock A, 50 mL de stock B, 6,5 mL de stock M et 1 mM d’acide L-ascorbique. Agiter délicatement à l’aide de mouvements rotatifs, jusqu’à dissolution complète de l’acide L-ascorbique. Ajouter de l’eau pour atteindre le volume final, sceller la fiole jaugée avec film d’étanchéité distillée et retourner doucement à 3 – 5 fois jusqu’à ce que la solution soit uniformément claire. Voir tableau 2 pour la tenue composition fsca. 7. préparation des bancs expérimentaux Remarque : Ceci nécessite 15 min, 30 min pour obtenir une température constante du bain chaud en plus. Banc d’enregistrement Commencer le bain chaud, réglez-le à 32 ° C et couvrez-la pour maintenir sa température.Remarque : Le bain chaud utilisé dans le présent protocole peut être fait sur mesure en utilisant une boîte en plastique dure et un thermostat aquarium réglé à la température désirée. Température constante peut le joindre en ~ 30 min à partir de la température ambiante. Étant donné que les chambres de préchauffage et incubation s’asseoir au fond de la boîte en plastique, le niveau d’eau doit être juste assez pour couvrir le thermostat afin de garder les chambres de flotter. Assembler la tenue et la chambre de préchauffage (cf. Figure 1 a) et pour la tenue FSCA en eux. Garder la chambre tenue à la température ambiante et placer la chambre de préchauffage à l’intérieur du bain chaud. Bouillir les solutions avec le mélange de gaz 95 % O25 % CO2 et éliminez les bulles piégées à l’aide d’une pipette Pasteur inversée. Garder couvert. Vibratome et banc de tranchage Coller un bloc de gélose petit vers le centre du disque échantillon à l’aide de colle cyanoacrylate. Placer un bécher de 250 mL dans un seau à glace et versez la coupe FSCA dedans. Prenez deux béchers de 100 mL et verser 50 mL de holding FSCA dans chacun. Laissez les béchers à température ambiante. Ce sont les béchers de rinçage. Bouillir les solutions avec un mélange de gaz 95 % O25 % CO2 . Monter le plateau de tampon sur le vibratome et entourer avec la glace pilée. Versez quelques éthanol sur la glace pilée pour aider à maintenir des températures froides pendant la procédure de tranchage. Après coulage d’éthanol, ajouter plus de glace que nécessaire.Remarque : Une température de 2 ° C est optimale. Placer le barboteur à l’intérieur de la cuve à tampon, puis assembler et monter le bloc de lame vibratome.Remarque : Assurez-vous que la lame est montée à angle de dégagement d’environ 10°. Conditionnés dans un bécher de 500 mL de glace pilée à 2/3 du volume et remplir avec de l’eau distillée. Sortez le bol congelé le congélateur, placez-le à l’envers sur le banc de tranchage et couvrir avec une serviette en papier et d’un disque de papier filtre. Banc d’anesthésie Placez un petit bol dans un bac rempli de glace et pour couper le FSCA dedans. Bouillir avec un mélange de gaz 95 % O25 % CO2 . 8. préparation de tranches et l’entretien du cerveau Remarque : Ce protocole utilise adulte (4 – 6 semaines-vieux) souris CD1 mâles, mais autres souches (p. ex., c57/bl617,18) peuvent être utilisé. Nous comparons également plus tard la sortie expérimentale obtenue à l’aide de coupes de cerveau de souris à celui résultant des tranches de cerveau obtenues de rats Sprague-Dawley mâles du même âge. Les étapes suivantes se rapportent à la préparation des tranches de cerveau partiellement déconnecté dans lequel interictal activité axée sur la CA3 rapide est restreint à l’hippocampe appropriée et ne peuvent pas être propagées à la cortex parahippocampique, comme décrits dans23. Déconnexion de l’hippocampe-cortex est une condition sine qua non pour poursuivre des études de modulation électrique dans l’utilisation de la préparation de tranches de cerveau hippocampe-EC. Le vibratome utilisé se réfère au modèle figurant dans la Table des matières. Autres modèles peuvent nécessiter une procédure différente. Anesthésier les rongeurs l’isoflurane mélange livré à une chambre d’induction de l’anesthésie à 2 L/min de gaz de 5 % dans un carbogen. Sous anesthésie profonde (ne pincent aucun réflexes en réponse aux pieds et pattes), extraire le cerveau moins de 1 min suivant les procédures standards comme à23. Placer le cerveau dans le petit bol contenant la coupe glacée équilibrée FSCA et laissez refroidir pendant 90 à 120 s.Remarque : Ne pas laisser le cerveau réfrigérer pendant trop longtemps, sinon il peut geler. Versez la coupe glacée FSCA dans le bac tampon. Répandre le FSCA de coupe sur le papier filtre placé sur le bol congelé. Placez le cerveau sur le papier filtre et isoler le bloc de tissu de cerveau nécessaire en retirant le cervelet et le mât de façade en découpant droit. Avec l’aide d’une spatule courbée, coller la face dorsale du cerveau sur le disque de spécimen face coupe frontale vers le bloc de gélose et le pôle occipital vers la lame vibratome. Utilisez une fine couche de colle cyanoacrylate. Placez le disque du spécimen dans le bac tampon immédiatement et fixez-le. Ajuster la gamme de découpe afin de déplacer la lame vibratome tout le chemin à travers le tissu, le bloc de gélose. Ajuster la hauteur du disque échantillon pour atteindre le niveau de la lame avec le bloc de tissu de cerveau. Jeter les coupes de tissus jusqu’à l’hippocampe est bien visible (généralement ~ 900 µm). Ensuite, définir une épaisseur de tranche de 400 µm et commencer à trancher pour conserver les sections de tissu. Pour chaque section de cerveau divisé les deux hémisphères et découper le tissu inutile pour obtenir deux tranches de cerveau. Comme le bac tampon est renforcé pendant les sections suivantes, remplir le fond de bac tampon avec l’eau distillée glacée (voir étape 7.2.7). Utiliser une pipette Pasteur inversée pour doucement les tranches de cerveau dans le bécher premier rinçage, vider la pipette Pasteur et du transfert des tranches de cerveau dans le bécher deuxième rinçage. Ensuite, transférer les tranches de cerveau dans la chambre de détention et les laisser récupérer pendant au moins 60 min.Remarque : Généralement, il est possible d’obtenir 6 à 8 tranches de cerveau globales. Le protocole peut être suspendu ici. 9. préparation du FSCA contenant 4-AP (4AP-ACSF) Note : Cela nécessite 10 min pour la préparation, ainsi que 20 min de réchauffement de la planète. Attention ! 4-AP est une drogue convulsivante et il est toxique. Manipuler avec des gants et ne pas renverser. Versez 200 mL d’eau distillée dans une fiole jaugée de 500 mL. Ajouter 50 mL de stock A, 50 mL de stock B, 5 mL de stock M et 1 mM d’acide L-ascorbique. Agiter délicatement à l’aide de mouvements rotatifs, jusqu’à dissolution complète de l’acide L-ascorbique. Ajouter 500 µL de 4AP stock. Ajouter de l’eau pour atteindre le volume final, sceller la fiole jaugée avec film d’étanchéité distillée et il retourner doucement 3 à 5 fois jusqu’à ce que la solution soit uniformément claire. Assembler la chambre d’incubation 4AP (cf. Figure 1 a) et verser environ 80 mL de 4AP-FSCA dedans. Couvrir la chambre, transférez-le vers le bain chaud et bouillir avec un mélange de gaz 95 % O25 % CO2 . Éliminez les bulles piégées à l’aide d’une pipette Pasteur inversée. Garder couvert. Attendez jusqu’à ce que la température de FSCA 4AP 30-32 ° C (~ 20 min).Remarque : Le protocole peut être suspendu ici si des tranches de cerveau sont remettent encore. 10. préchauffage et l’Incubation des tranches en 4AP (durée : 90 min) Vérifiez que le FSCA de préchauffage et la température 4AP-FSCA est 30-32 ° C. Utilisez un inversé pipette Pasteur en verre pour transférer 1 tranche de cerveau dans la chambre de préchauffage et laisser le reste de tissu pour 25-30 min. Ensuite, transférer la tranche de cerveau dans la chambre d’incubation 4AP-ACSF et laissez-la reposer pendant 60 min. 11. préparation de la mise en place MEA Remarque : Commencez à 15 min avant l’enregistrement. Transvaser le volume restant de 4AP-FSCA dans un erlenmeyer de 500 mL. Placer l’erlenmeyer sur une étagère au-dessus de l’amplificateur de la MEA et utiliser de tubes pour permettre à la solution alimenter en permanence une seringue de 60 mL. Régler la hauteur de l’erlenmeyer et la seringue pour permettre un taux gravitaire de 1 mL/min.Remarque : La bonne hauteur dépend du diamètre intérieur du tube (ID). Pour les tubes de 5/32 po ID 30 cm suffisent. Bouillir la 4AP-FSCA dans l’erlenmeyer et dans la seringue avec un mélange de gaz 95 % O25 % CO2 . Laissez la 4AP-FSCA ne circule par l’intermédiaire de la tubulure de perfusion dans un bécher jusque là aucun flux d’air à l’intérieur ; puis arrêter l’écoulement de la solution. Connecter à la base de la MEA, l’élément de chauffage au thermostat. Placer la puce MEA sec à l’intérieur de l’amplificateur de la MEA et fixer la tête d’ampli. Utiliser une pipette Pasteur en plastique pour transférer 4AP-FSCA jusqu’à l’inlet et le réservoir externe de la chambre d’enregistrement. Fixer la canule de chauffage à un Magnet holder et placer sa pointe à l’intérieur de l’orifice d’entrée chambre enregistrement ; Visser le support magnétique sur une bande magnétique sur la tête d’ampli MEA ; Raccorder la tubulure de perfusion à la canule ; Connectez la canule au thermostat.Remarque : La canule de chauffage devrait être couverts par tube biseauté en polytétrafluoroéthylène (PTFE) pour atteindre la chambre d’enregistrement d’entrée et de réduire au minimum le bruit dû au matériau métallique de la canule. Quand le réservoir d’entrée est suffisamment rempli de 4AP-ACSF, gouttes tombant du système de perfusion ne doivent pas être visibles. Placer l’aiguille d’aspiration dans le réservoir et vérifier qu’il n’y ait une pression négative en immergeant l’aiguille d’aspiration dans le FSCA ; vous recherchez un bruit d’aspiration constant de basse fréquence.Remarque : L’aiguille d’aspiration devrait être placé afin de permettre la 4AP-FSCA couler juste au-dessus de la surface du cerveau tranche. Une ligne vide ou une pompe à vide faible bruit peut être utilisée. Régler le régulateur de débit pour permettre un débit de 1 mL/min et commencer perfusant.NOTE : Perfusion gravitaire élimine le bruit qui pourrait être causé par des pompes péristaltiques ; Si les pompes péristaltiques sont préférés, des modèles de faible bruit sont obligatoires. Une fois 4AP-FSCA ne circule dans la canule, tournez sur le thermostat. Définissez la canule de chauffage à 37 ° C et la base de la MEA à 32 ° C pour obtenir une température de 32 à 34 ° C à l’intérieur de la chambre d’enregistrement.Remarque : attention ! Jamais chaleur la canule sans solution en elle ou il pourrait être endommagé de façon irréversible. Régler la température de la canule supérieure à la température de l’enregistrement (p. ex., 32-34 ° C) afin de tenir compte du décalage de température intrinsèque entre la valeur de consigne et la valeur réelle à l’extrémité de la canule de chauffage et au sein de la chambre d’enregistrement. Le débit, la température de l’environnement et volume de l’enregistrement de la chambre toute influence de la température de la solution d’enregistrement. Les paramètres déclarés à l’étape 11,9 sont optimisées pour le protocole décrit et équipement. Toujours vérifier la température d’enregistrement à l’aide d’un thermocouple et ajuster les paramètres selon les besoins. Ne pas chauffer la base MEA supérieures à 34 ° C pour éviter la surchauffe de la tranche de cerveau. Placer l’électrode de référence externe dans le réservoir d’entrée de chambre enregistrement.Remarque : Bien que les puces de la MEA sont équipées d’une électrode de référence interne, cela est couvert par la chambre d’enregistrement personnalisé. Ainsi, une électrode de référence externe doit être utilisée. Une boulette de KCl saturée est le plus pratique, car il est prêt à l’emploi sans besoin de chloration. 12. MEA vivre cartographie Une fois le niveau 4AP-ACSF et l’enregistrement de la température sont stabilisés comme désiré, tourner la perfusion et les robinets d’aspiration à la position off pour les arrêter temporairement. Transférer rapidement une tranche de cerveau sur la chambre d’enregistrement de la MEA en utilisant une pipette Pasteur en verre inversé. Régler sa position sur la zone d’enregistrement MEA comme nécessaires en utilisant une pipette Pasteur recourbée poli feu (Figure 1) ou un pinceau petit compact. Placez le point d’ancrage de fixation (Figure 1) sur la tranche de cerveau. Redémarrez la perfusion et l’aspiration en remettant leurs robinets d’arrêt à la position on.Remarque : critique ! La tranche doit être transférée, et la perfusion redémarré dans les 60 s ou le tissu pourrait mourir. L’ancre de fixation tranche doit être conservé dans 4AP-FSCA pour empêcher que la tranche de cerveau tout en plaçant le point d’ancrage sur la tranche de cerveau en raison de différences de tension superficielle. L’ancre pour garantir la tranche de cerveau sur la MEA peut être fait sur commande à l’aide d’acier inoxydable en nylon et fil thread (Figure 1) ou obtenus de sources commerciales. 1E de la figure montre le montage expérimental final avec la puce MEA raccordé à tête de l’amplificateur : une tranche de cerveau reposant sur la puce MEA au sein de la chambre d’enregistrement est maintenue enfoncée de l’ancre personnalisé. L’électrode de référence (cercle rouge) et celle du PTFE, tube couvrant la canule de chauffage (flèche rouge) sont placés dans le réservoir d’arrivée, alors que l’aiguille d’aspiration (flèche bleue) est placé dans le réservoir de sortie. Prendre une photo de la tranche de cerveau à l’aide d’une caméra montée sur une scène de microscope inversé. Exécutez le script mapMEA sur le logiciel d’ordinateur pour lancer l’interface graphique pour mapper les électrodes.Remarque : Le logiciel sur mesure permet à l’utilisateur de sélectionner les électrodes qui correspondent à des structures spécifiques de la tranche de cerveau. Cette étape est cruciale pour activer la voie correcte et de supprimer l’activité spontanée à l’aide d’une stimulation électrique. Fig 2 : GUI pour vivre cartographie électrode MEA. (A) Représentation schématique de la tranche de combiné hippocampe-EC positionnée sur la MEA. Les structures par défaut utilisés pour ce protocole sont cornu ammonis 3 (CA3), cortex enthorinal (EC), cortex périrhinal (PC) et le subiculum (SUB). L’électrode de référence est schématisé comme marqueur triangle. Électrodes encerclés en pointillés représentent les coordonnées XY pour redresser l’image. Capture d’écran (B) de l’interface utilisateur au cours du mappage direct de la MEA. Le diagramme sur la gauche de la capture indique la procédure étape par étape à suivre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Cliquez sur le bouton Parcourir pour charger l’image de la tranche de cerveau. S’assurer que l’électrode de référence apparaît dans la ligne supérieure de la moitié-côté gauche de la MEA (Figure 2 a, marque de triangle). Cliquez sur le bouton Activer pointeur , puis sélectionnez les électrodes en haut et en bas de la ligne plus à gauche du tableau pour marquer les coordonnées XY pour lissage d’image et la cartographie de l’électrode. Dans le menu de liste déroulante type de tranche , sélectionnez Horizontal. Cochez la case par défaut de structures .Remarque : Il est possible de personnaliser les structures en cliquant sur le bouton Entrer de nouvelles Structures . Les structures par défaut pour la tranche de cerveau horizontaux sont représentés dans la Figure 2 a. En utilisant les touches numérotées sous la photo de tranche de cerveau, sélectionnez les électrodes correspondant pour le retour sur investissement et cliquez sur le bouton correspondant dans le panneau de structures pour les affecter (Figure 2 b) ; Répétez cette étape pour chaque ROI. Appuyez sur le bouton Enregistrer : le logiciel génère un dossier de résultats nommé #EXP_LabelledElectrodes contenant une table des électrodes choisies et les ROIs de la déclaration. 13. enregistrement et électrique de Modulation de l’activité épileptiforme Permettre la tranche de cerveau à se stabiliser dans la salle d’enregistrement pendant 5-10 min avant l’enregistrement. Allumez le stimulus unité au moins 10 min avant le protocole de stimulation pour permettre l’autocalibrage et stabilisation. Lancez le logiciel de contrôle de stimulus et vérifiez que stimulateur et un amplificateur de la MEA sont correctement connectés comme indiqué par une LED verte du tableau principal du logiciel de contrôle de stimulus. Veuillez vous reporter aux manuels des instruments spécifiques et des logiciels pour plus de détails, cf. Table des matières. Mettre en place la stimulation en configuration bipolaire. Sélectionnez les paires électrode en contact avec la couche de cellules pyramidales de la région CA1/proximale subiculum (cf.24,25) parmi ceux mappés avec le script mapMEA (cf. article 12). Utilisez un fil pour connecter une des électrodes choisies à la fiche négative du stimulateur et l’autre électrode à la fiche positive d’un même canal stimulateur. Utilisez un autre câble pour connecter le sol du stimulateur sur le sol de l’amplificateur. Démarrer le logiciel d’enregistrement. Pour acquérir des données, appuyez sur le bouton lecture dans le panneau principal du logiciel enregistrement. Les rejets de dossier au moins 4 ictal.Remarque : Une fréquence de 2 kHz permet d’acquérir des potentiels de champ avec une résolution équitable tout en minimisant l’utilisation de l’espace disque dur. Un fichier d’enregistrement de 5 min prend ~ 80 Mo. Fréquences d’échantillonnage plus élevées peuvent être nécessaires, par exemple, aux artefacts de relance record ou logements multiples activité. Pour observer les potentiels de champ seulement, utiliser un filtre passe-bas direct à 300 Hz à interrompre leurs multiples activités. Déterminer l’intensité de stimulation. Dans le logiciel de contrôle de stimulus, utilisez le panneau principal pour une durée d’impulsion courant biphasique carré positif-négatif de 100 µs/phase de conception.Remarque : attention ! Courant continu stimulation nécessite une impulsion de charge équilibrée pour éviter d’endommager l’équipement. Exécution d’un test de (e/s) d’entrée/sortie rapide pour déterminer l’intensité de stimulation meilleure. Fournir l’impulsion stimulation conçue à l’étape 13.5.1 à inférieures à 0,2 Hz en ajoutant un intervalle inter impulsion de 5 s ou plus sous une forme appropriée du logiciel de contrôle de stimulus. Dans l’onglet de l’amplitude de l’impulsion , entrez une amplitude de l’impulsion initiale de 100 µA/phase et augmenter par pas de 50-100 µA à chaque essai, jusqu’à ce que la stimulation peut évoquer avec fiabilité intercritiques-comme des événements dans le cortex parahippocampique (vérifier les signaux visualisés par le logiciel d’enregistrement). Modulation électrique d’ictogenèse limbique Programme de l’unité de stimulation pour fournir le protocole de stimulation de l’intérêt. Utilisez l’amplitude de stimulation identifié lors de l’essai de I/O.Remarque : Le taux d’échec des réponses évoquées doit être ≤ 20 %. Après l’arrêt de la stimulation, vérifier la récupération réseau à condition de stimulation préalable en inscrivant au moins 4 rejets ictales (comme dans l’étape 13,4).

Representative Results

AME plane avec mise en page et l’espacement des électrodes 500 µm 6 x 10 sont le dispositif d’enregistrement idéal pour le protocole expérimental décrit ici, puisque leur zone d’enregistrement s’étend tout au long de la tranche de cerveau dans son intégralité (Figure 3 a, voir aussi17). Bien qu’ame perforé (pMEAs) serait préférable pour améliorer l’oxygénation des tissus, leur zone d’enregistrement est trop petit (environ 2 mm de diamètre). Cela ne permet pas la visualisation simultanée des signaux électriques générés par l’hippocampe et le cortex parahippocampique (données non présentées ; voir18). La tendance observée épileptiforme induite par la 4AP (Figure 3 a) reproduit fidèlement ce qui est généralement observé dans ce modèle in vitro utilisant un éventuel enregistrement champ conventionnel et comprend trois types d’activité7, 26: (i) ictal comme événements (Figure 3 b, pointes de flèches) sont robustes durables (> 20 s, portée : 20-60 s) événements ressemblant aux électrographiques caractéristiques des convulsions toniques et cloniques composants (Figure 3) ; ils sont générés dans le cortex parahippocampique toutes les 3-5 min et entrez à nouveau la formation hippocampique dans le gyrus denté (Figure 3D, flèche) ; (ii) les rejets d’interictal comme lents (Figure 3 b, EC trace, de la barre noire ; élargi en Figure 3E) sont courts (< 1 s) événements de population générés entre ictales événements partout au sein de la préparation de tranches de cerveau hippocampe-EC et se produisent à une lenteur (entre 10-30 s) ; (iii) rapidedécharges intercritiques ressemblant (Figure 3 b, CA3 trace, barre noire ; agrandi en Figure 3E) sont récurrents en bref (< 1 s) événements de population générés par le sous-champ de CA3 hippocampal ; Lorsque les collatérales de Schaffer sont préservés, événements intercritiques rapide axée sur la CA3 se propagent le long de la boucle de l’hippocampe et exercent un anti-ICTOGENIQUES effet24 (données non présentées) ; pour empêcher l’activité ictale délabrée, aux fins du protocole décrit, CA3 sortie est perturbée (cf. Figure 3 b, E). Il faut noter que l’activité intercritiques rapide axée sur la CA3, enregistrée à l’aide des montants éligibles maximum se produit à un rythme plus lent (~ 0,4 Hz) que ce qui est observé à l’aide de potentiel de champ classique d’enregistrement avec pipettes en verre (~ 1 Hz, gamme : 0,5 – 2,0 Hz, données non présentées). L’issue heureuse de la neuromodulation électrique dans des tranches de cerveau rongeurs dépend de l’activation des voies neuronales spécifiques27 ainsi que la connectivité intrinsèque entre les régions incluses dans la préparation de24. Nous avons testé les tranches obtenues de rats Sprague-Dawley mâles adultes et souris CD1 et nous avons trouvé que la souris plutôt que des coupes de cerveau de rat offrent le meilleur compromis entre taille, épaisseur et connectivité intrinsèque. Tout d’abord, grâce à leur petite taille, ils la zone petit enregistrement des AME commercialement disponible meilleur ajustement (Figure 4 a, à gauche : rat, droite : souris) ; Deuxièmement, ils résistent mieux à la condition défavorable qui est intrinsèque à l’enregistrement de la MEA (cf. Introduction) : bien qu’ictal comme rejets générés par ces deux tissus (Figure 4 b) sont d’une durée similaire ()Figure 4 gauche), leur taux d’occurrence est significativement plus courte dans les coupes de cerveau de souris (n = 10 tranches de chaque espèce ; 2 non apparié t-test bilatéral, p < 0,001 ; Droit de la figure 4 ). Ce dernier permet d’accélérer les protocoles expérimentaux, ce qui permet de tester un plus grand nombre de tranches de cerveau pendant une seule journée expérimentale : pour cet ensemble de résultats représentatifs, nous avons pu tester un nombre similaire de tranches de cerveau chez les deux espèces (rat : n = 58 ; souris : n = 52), mais le nombre de souris (n = 18) a été 2 fois plus petit que le nombre de rats (n = 42). En outre, les coupes de cerveau de souris semblent présenter avec des connexions plus denses et sont donc plus susceptibles de mieux répondre à la neuromodulation électrique soutenue (Figure 4). Ainsi, ce modèle in vitro d’ictogenèse, la viabilité pour une stimulation électrique vise à contrôler l’activité spontanée est significativement plus élevée chez les souris que pour le tissu de cerveau de rat. Cet aspect est également reflété par le taux de réussite beaucoup plus élevé de stimulation d’expériences réalisées à l’aide de souris contre des coupes de cerveau de rat, même dans le cadre de plusieurs protocoles de stimulation soutenue ()Figure 4E). En fait, le tissu de cerveau de souris semble mieux résister à une stimulation électrique soutenue comme suggéré par le taux de survie plus élevé dans le délai expérimental testé de 4 h (Figure 4F). Par conséquent, la plus petite taille ainsi que de la meilleure préservation de la connectivité intrinsèque fait coupes de cerveau de souris le candidat le mieux placé pour exécuter MEA enregistrement visant à étudier les interactions réseau hippocampe-parahippocampique et évaluer électrique protocoles de neuromodulation qui se rapportent à la TLE. La stimulation périodique envoyées dans la région CA1/subiculum est connue pour contrôler ictogenèse limbique dans l’hippocampe-EC traités 4AP tranche préparation24,25,27, avec 1 Hz comme le plus efficace de fréquence27. Ainsi, il est également utile comme témoin positif pour évaluer l’efficacité et l’efficience des autres politiques de la neuromodulation (voir, par exemple,25). Comme mentionné ci-dessus, les impulsions électriques envoyées directement par le biais de l’AEM (c’est-à-dire, sans la nécessité d’une électrode de stimulation externe) peuvent évoquer des réactions des populations dans les tissus cérébraux de rongeurs (voir aussi28). Préservation suffisante de connectivité de réseau neuronal dans la tranche de cerveau, un positionnement précis de la tranche de cerveau sur la MEA et le choix approprié des paires d’électrodes stimulant permettent de poursuivre neuromodulation électrique des expériences qui contrôler efficacement ictogenèse. Comme illustré à la Figure 5 a, il est possible de reproduire la canonique 1Hz périodique stimulation protocole utilisant ame plane comme un enregistrement et un dispositif stimulant, avec l’avantage supplémentaire que l’effet de la stimulation électrique peut être visualisée dans toute la section le tissu de cerveau avec un nombre plus élevé également espacés de points d’observation par rapport à l’enregistrement de potentiels de champ conventionnel. Figure 5 b montre la quantification des résultats obtenus pour n = 9 tranches de cerveau, ce qui indique une réduction significative du total s’emparant de temps (activité spontanée totale durée/observation temps25) pendant la stimulation (une façon-ANOVA, F(df) : 6.84(2), p < 0,01, de LSD post hoc Fisher, protégé). Les résultats sont en accord avec la littérature pour externe stimulant électrodes24,25. Pour calculer le total s’emparant de temps, le temps d’observation dépend de l’intervalle entre les événements critiques, et il détermine également la durée minimale du protocole de stimulation nécessaire d’évaluer avec certitude les effets de la neuromodulation. Nous constatons que l’enregistrement au moins 4 rejets ictales (et donc au moins 3 intervalles entre événements ictales) est un bon compromis entre les échantillons recueillis et l’heure de la collection requise. Dans l’état de contrôle (c.-à-d., aucune stimulation), l’heure de l’observation est le décalage entre l’apparition du premier événement ictal mesurée et la fin de cette dernière. Au cours de la neuromodulation, l’heure de l’observation est égale à la durée de protocole de stimulation, étant donné que l’objectif de la mesure est de quantifier les phénomènes qui se produisent pendant tout le temps que la perturbation est introduite dans le système. Informatique et en comparant le total s’emparant de temps plutôt que de la durée et l’intervalle des événements ictales sont le paramètre plus approprié afin d’éviter le type erreur d’II. En fait, ainsi que la suppression complète de l’activité spontanée, il est également possible qu’un seul événement ictal est généré au cours de la stimulation électrique par opposition à plusieurs événements observés dans la condition de contrôle. Dans ce cas, alors qu’il n’est pas possible de mesurer l’intervalle entre les événements, mesurant la durée constatée comme un estimateur de l’efficacité de la stimulation ne représente pas le résultat réel de neuromodulation (c.-à-d., réduction de l’activité spontanée). Dans l’ensemble, les résultats présentés ici montrent que des coupes de cerveau de souris couplés à l’AME sont des outils précieux pour la recherche sur l’épilepsie et de réaliser des études de neuromodulation fiables qui sont pertinentes pour faire progresser le domaine de la DBS pour le traitement de l’épilepsie. En outre, le protocole décrit ici améliore la viabilité de tranches de cerveau et permet de poursuivre les sessions expérimentales pendant plusieurs heures (Figure 6), qui pourraient être nécessaire, par exemple, pour comparer les effets de la stimulation électrique différente paradigmes. Figure 3 : Modèle typique épileptiforme induite par la 4AP visualisé avec mesure planar (A) souris brain tranche positionné sur un planar MEA 6 x 10 (écartement de l’électrode : 500 µm) et side-by-side vue d’ensemble du modèle épileptiforme induite par la 4AP visualisé avec enregistrement de MEA. Chaque carré de la grille s’adapte à l’activité enregistrée à l’emplacement correspondant dans la tranche de cerveau. Les lignes pointillées bleues voir les lignes d’électrode pour plus de clarté. Le numéro d’enregistrement électrode est identifié en bleu dans le coin supérieur gauche de chaque carré. Le gris traversé carré représente l’électrode de référence. (B) les segments de trace représentative des patrons ce et CA3 visualisés à une échelle de temps plus rapide. Pointes de flèches indiquent les événements ictales. Dans la trace de l’EC, il est possible d’apprécier la présence de lentes décharges intercritiques (noirs bar), tandis que le sous-champ CA3 génère le schéma typique fastinterictal soutenue (barre noire). (C) élargi d’enregistrement d’une décharge ictale montrant le modèle tonico-clonique typique. (D) visualisation rapide à l’échelle de la transition pre-ictal-à-ictal correspondant aux segments de CA3 (noire) et EC (rouge) marquée par la barre rouge au point B. La flèche indique le début de la décharge spontanée. Les traces superposées mettent en évidence que l’événement ictal est originaire de la Communauté européenne et par la suite se propage au sous-champ CA3. (E), la vue développée des périodes intercritiques marquée par les barres noires (b) met l’accent sur l’absence de corrélation entre la lente et fastinterictal modèles générés par la CE (rouge) et CA3 (noir), respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Tranches de cerveau de souris offrent un rendement expérimental plus élevé que les coupes de cerveau de rat. (A) cerveau trancher d’un rat (à gauche) et une souris (à droite) d’âges correspondants. La tranche de cerveau de rat est beaucoup plus grande que la zone d’enregistrement de la MEA et son activité électrique ne peut être visualisée dans son intégralité. (B) comparaison visuelle directe de l’activité ictale récurrente générée par le cortex enthorinal de souris et le rat (EC). (C) Coupes de cerveau de souris et le rat génèrent des rejets individualisées de durée similaire, mais l’intervalle entre ces événements est le tissu de cerveau de rat en presque 2 fois. * p < 0,05. (D) comparativement à des rats, des souris offre un rendement supérieur 2 fois des tranches de cerveau viables pour des expériences de stimulation électrique visant à contrôler l’ictogenèse. La stimulation électrique de la subiculum pourrait évoquer les réactions des populations dans le cortex parahippocampique dans seulement 20 des 58 tranches de cerveau rat (34 %) cerveau tranches, par opposition à 33 52 (63 %) souris (Chi2: 9.22 ; p = 0,002). p < 0,05. (E) parmi les tranches viables, le taux de réussite en contrôlant l’activité spontanée est 2 fois avec la souris par rapport à des coupes de cerveau de rat (souris : 20 des tranches de cerveau 33, 60 % : rat : 6 de 20 tranches de cerveau, 30 % ; Chi2: 4,67 ; p = 0,03). p < 0,05. Souris (F) peuvent résister à des tranches de cerveau répété prolongée des époques de la stimulation électrique soutenue (gris-ombrées). Après retrait du stimulus, tissu de cerveau de souris présente une restauration complète du modèle épileptiforme, alors que la viabilité de tissu pour le cerveau rat tombe considérablement à 3 h. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Une expérience représentative de modulation électrique d’ictogenèse en utilisant des tranches de cerveau couplé à la mesure (A) enregistrements d’activité ictale induite par la 4AP dans la Communauté européenne et le PC au cours de la condition de contrôle (aucune stimulation), périodique (PP) de la stimulation à 1 Hz (artefact de stimulation est tronqué) et lors de la récupération après retrait du stimulus. (B) la Quantification de l’effet de PP à 1 Hz sur le total, s’emparant de temps. p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Enregistrement longue durée représentative de l’activité spontanée induite par la 4AP. Trace (A) les segments enregistré 8 h après le cerveau tranchage procédure et suivant 2 h d’application 4AP. Expanded (B) tracer des segments correspondant aux décharges ictales boxed identifiés par les lettres a, bet c dans panneau (A) Voir la la cohérence de l’activité ictale générée tout au long de l’observation prolongée temps-veuve. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Stock A Produit chimique Poids moléculaire Concentration (mM) NaCl 58.44 1150 Solvant : eau distillée JCM 74.55 20 Concentré : 10 x KH2PO4 136.1 12,5 Température de stockage : 4 ° C CaCl2* 2 H2O 147,02 20 Durée de conservation maximale : 1 SEM D-Glucose 180,2 250 Remarque : filtrer à l’aide d’un filtre à membrane 50 mm Stock B Produit chimique Poids moléculaire Concentration (mM) NaHCO3 84.01 260 Solvant : eau distillée Concentré : 10 x Température de stockage : 4 ° C Durée de conservation maximale : 1 SEM Remarque : filtrer à l’aide d’un filtre à membrane 50 mm Stock C Produit chimique Poids moléculaire Concentration (mM) JCM 74.55 20 Solvant : eau distillée KH2PO4 136.1 12,5 Concentré : 10 x MgCl2* 6 H2O 203,3 50 Température de stockage : 4 ° C MgSO4* 6 H2O 246.47 20 Durée de conservation maximale : 2 semaines CaCl2* 2 H2O 147,02 5 Remarque : filtrer à l’aide d’un filtre à membrane 50 mm Stock M Produit chimique Poids moléculaire Concentration (mM) MgSO4* 6 H2O 246.47 100 Solvant : eau distillée Concentré : 100 x Température de stockage : 4 ° C Durée de conservation maximale : 4 semaines Stock de 4AP Produit chimique Poids moléculaire Concentration (mM) 4-aminopyridine 94,11 250 Solvant : eau distillée Concentré : 1000 x Température de stockage : 4 ° C Durée de conservation maximale : 2 semaines Remarque : Vortexer pendant 2-3 min ou stirr pendant 30-60 min Remarque : attention ! 4-AP est toxique et cinvulsant. Utilisez des gants et d’éviter de répandre ou renverser. Tableau 1 : Les solutions de Stock. HOLDING FSCA ENREGISTREMENT FSCA COUPE FSCA Produit chimique C [mM] Produit chimique C [mM] Produit chimique C [mM] NaCl 115 NaCl 115 Saccharose 208 KCl 2 KCl 2 KCl 2 KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25 KH2PO4 1.25 MgSO4 1.3 MgSO4 1 MgCl2 5 CaCl2 2 CaCl2 2 MgSO4 2 D-glucose 25 D-glucose 25 CaCl2 0,5 NaHCO3 26 NaHCO3 26 D-glucose 10 Acide L-ascorbique 1 Acide L-ascorbique 1 NaHCO3 26 Acide L-ascorbique 1 pH 7.4 pH 7.4 Acide pyruvique 3 Osmolalité 300 mOsm/Kg Osmolalité 300 mOsm/Kg pH 7.4 Osmolalité 300 mOsm/Kg Tableau 2 : Composition de Solutions. Dépannage QUESTION CONTRE-MESURES Ictales rejets regarder « chunked » Réduire la vitesse de perfusion et/ou de baisser le volume de l’ACSF au-dessus de la tranche de cerveau en ajustant la position de l’aiguille d’aspiration. Aucune activité spontanée (1) vérifier qu’axée sur la CA3 rapide intercritiques événements ne sont pas propagent vers le cortex. Utilisez une lame de bistouri petites (p. ex., n.10) ou une aiguille de rompre les collatérales de Schaffer si besoin être, mais veillez à ne pas couper les fils en nylon de l’ancre de fixation de tranche. Une stéréo – ou le microscope vertical conviennent le mieux, alors que le microscope inversé rend cette tâche très difficile. (2) vérifier la viabilité de la tranche : forte stimulation électrique peut déclencher des activités individualisées ? Attendre environ 2 h d’application 4AP, puis changer de tranche de cerveau si activité ictale ne se produit pas. La tranche de cerveau se déplace lorsque vous placez le point d’ancrage de fixation (1) doucement Retirez l’ancrage de la tranche et repositionner la tranche de cerveau. (2) vérifier que l’ancrage de la tranche est uniformément humide de 4AP-fsca. (3) supprimer la 4AP-FSCA de la chambre d’enregistrement pour favoriser l’adhérence de tranches de cerveau à l’AEM. (4) repositionner l’ancre de fixation de tranche. La tranche de cerveau flotte sur la puce de la MEA, après avoir été transféré (1) aspirer doucement FSCA excédentaire avec une pipette Pasteur. (2) puce de la MEA devrez peut-être re-enduit. Stimulation électrique ne pas obtenir des réponses de réseau Augmenter l’intensité du stimulus, changer de paires d’électrodes. Stimulation électrique peut déclencher des réactions des populations dans les zones corticales proximales mais pas distales La question est ikely en raison de la mauvaise connectivité ou l’intensité de la stimulation trop faible. Stimulation électrique peut être inefficace ou efficace dans certaines aires corticales seulement. Il est recommandé de changer de tranche de cerveau. Le signal est perturbé (1) Vérifiez l’électrode de référence : référence bruyant parfois peut être causée par le remplissage incomplet du réservoir d’entrée tels que les électrodes de référence ne pas complètement dans le fsca. (2) vérifier la mise à la terre globale de l’équipement. (3) régler la position de l’aiguille d’aspiration afin de percevoir un bruit de succion constant et doux. L’aiguille d’aspiration à la terre. (4) nettoyer les contacts externes MEA avec de l’éthanol à l’aide d’un coton-tige. (5) puce de la MEA peut être endommagé : changer la puce de la MEA et vérifier les artefacts et le rapport signal-bruit. Tableau 3 : dépannage.

Discussion

AME est un outil inestimable pour les enquêtes de la neurophysiologie et ont atteint la maturité ces dernières années grâce à des décennies d’exploration et d’aménagement. Par rapport au domaine conventionnel de l’enregistrement potentiels, Ame offre le grand avantage d’un plus grand nombre de points d’observation et de la distance inter électrode connue, qui sont cruciales pour localiser avec précision les interactions réseau neuronal.

La technique d’enregistrement MEA peut également être couplée à d’autres approches de l’électrophysiologie, notamment enregistrement patch clamp¹⁵, pour étudier la relation entre seul neurone et l’activité de réseau neuronal. En outre, la possibilité de visualiser simultanément les potentiels de champ et l’activité de plusieurs unitée peut fournir un aperçu précieux de la corrélation entre l’activité des petits ensembles neurones et les réseaux neuronaux collectives. La combinaison avec les colorants sensibles au voltage, imagerie calcique et optogenetics²⁹ permet de déduire des phénomènes de neurophysiologie à l’aide d’approches polyédriques. En plus des études pharmacologiques, la possibilité d’effectuer l’enregistrement et la stimulation avec le même système rend la technique d’enregistrement MEA très puissant et polyvalent : par exemple, il est possible d’étudier les phénomènes de plasticité synaptique à la noyau de mémoire formation³⁰, en utilisant les protocoles de neuromodulation présentés ici, qui sont pertinentes pour la DBS pour traiter l’épilepsie et une grande variété de troubles cérébraux. La preuve récente que la technique d’enregistrement MEA peut être appliquée avec succès à l’humain cerveau épileptique tissu¹⁶ démontre son utilité inestimable dans la recherche sur l’épilepsie, tant pour comprendre les mécanismes de base qui sous-tendent cette maladie dévastatrice et d’affiner les algorithmes DBS pour améliorer il.

Toutefois, Ame force la poursuite d’expériences d’électrophysiologie dans des conditions « limite » pour des tranches de cerveau, en raison de l’exigence d’une chambre d’enregistrement submergé et la nécessité de laisser le cerveau tranche reste sur le substrat solid où les micro-électrodes sont intégrés. Ainsi, le tissu cérébral ne peut recevoir d’oxygène adéquat, ce qui à son tour, peut affecter la qualité des enregistrements.

Le protocole décrit ici permet d’enregistrer de manière fiable et ictogenèse dans les réseaux limbiques rongeurs couplés à l’AME en utilisant le modèle aiguë 4AP in vitro d’étude et de poursuivre des époques prolongées de la stimulation électrique, qui fournissent des informations pertinentes pour l’évaluation des politiques DBS.

Des études antérieures sur la neuromodulation électrique des réseaux limbiques épileptiques, basée sur l’utilisation de domaine conventionnel potentiels de l’enregistrement ont utilisé des coupes de cerveau de souris ou rat avec similaires résultats²⁴^,²⁵; mais l’utilisation du tissu de cerveau de rat s’est avérée plus difficile, raisonnablement en raison de la connectivité plus faible par rapport au tissu cérébral provenant de souris⁷. En ce qui concerne la technique de la MEA, les coupes de cerveau de souris sont les mieux adaptés en raison de leur petite taille. En outre, étant donné le taux plus élevé d’apparition de rejets ictal-comme chez les souris contre le tissu de cerveau de rat, il est possible de tester des tranches de cerveau beaucoup plus tout au long d’une journée expérimentale, qui à son tour rend la collecte de données plus rapide et plus efficace, et peut réduire le nombre d’animaux utilisés.

Importance en ce qui concerne les méthodes existantes :

Ictales rejets enregistrés en utilisant la chambre personnalisée décrite ici semblent être similaires à durée et taux d’occurrence à celles observées à l’aide de la chambre de bague MEA conventionnelle et le même type MEA (micro-électrodes planaires, cf. ¹⁷). Cependant, il faut souligner que les épaisseur de tranche de cerveau doit être considérablement réduit lorsqu’à l’aide de la chambre d’enregistrement ronde conventionnelle avec un taux de perfusion faible (1 mL/min), qui peut entraver la poursuite réussie de neuromodulation expériences due connectivité à médiocre.

Dans ce protocole, une chambre d’enregistrement personnalisé de faible volume inspirée par le patch clamp enregistrement chambre design fournit à flux laminaire stable et fiable qui est cruciale pour la poursuite réussie d’enregistrements MEA ; Il permet également l’augmentation de l’épaisseur de tranche de cerveau à 400 µm afin de parvenir à un compromis équitable entre la viabilité des tissus et connectivité intrinsèque. Il est en effet reconnu que le flux laminaire de la solution d’enregistrement au sein de la chambre est hautement souhaitable pour l’électrophysiologie de tranche de cerveau, puisqu’il n’est pas affecté par la température, l’oxygène, et des gradients de pH qui sont observés dans le flux circulaire rond enregistrement chambres¹⁹^,²⁰^,³¹ (telles que celles fournies avec MEA disponible dans le commerce). Ces gradients introduisent un biais expérimental et nuisent également à la tranche de cerveau. Chambres d’enregistrement d’un volume relativement faible (~1.5 mL) avec une perfusion de haute fréquence (5 à 6 mL/min)¹⁶^,³¹ permettant un échange adéquat du milieu de perfusion (≥ 3 fois / min). La chambre personnalisée peut être facilement obtenus de sources commerciales à un prix abordable ou produits interne utilisant la technologie d’impression 3D. D’autres études ont signalé des enregistrements MEA de 400 des tranches de cerveau humain µm d’épaisseur¹⁶ à l’aide de la chambre de bague MEA classique, tout en gardant le volume de l’ACSF à 1 mL et appliquer un taux de perfusion élevé (5 à 6 mL/min) avec l’aide d’une pompe péristaltique à faible bruit. Toutefois, les auteurs ont utilisé un modèle différent d’ictogenèse, c’est-à-dire, la faible Mg^{2 +}, qui est probablement que moins influencé que le modèle 4AP ephaptic mécanismes impliquant une augmentation significative de la concentration extracellulaire de K⁺ ¹¹ ^, ²². nous avons constaté qu’un taux de perfusion élevé n’est pas souhaitable dans le modèle 4AP, peut-être en raison de la rapide lavent d’accumulé K extracellulaire⁺, qui doive être considérablement accrus dans l’enregistrement FSCA¹⁶. En fait, événements ictales est apparu plus « chunked » lorsque la vitesse de perfusion FCSA est passé à 2-3 mL/min et la tranche de cerveau a été submergée par une épaisse couche de l’ACSF, considérant que véritables rejets présentant des composants tonico-clonique robustes pourraient être rétablies dès le retour à un plus faible taux de perfusion (1 mL/min) et un FSCA plus mince couche droite à la surface du tissu (données non présentées). La chambre d’enregistrement personnalisé décrite dans le présent protocole permet d’échanger le milieu de perfusion 3 – 5 fois / min pour un débit de 1 mL/min. Ainsi, l’alimentation en oxygène global pour les tranches de cerveau est fortement améliorée même à des taux relativement faibles de perfusion, tout en garantissant toujours une écurie d’enregistrement température et rapport signal sur bruit élevé. Plus important encore, il est possible de garder la concentration extracellulaire de K⁺ une valeur physiologique.

Le modèle 4AP ictogenèse ne nécessite pas de toute modification significative de la composition ionique du FSCA, telles que l’abaissement Mg^{2 +} ou croissant K⁺et offre l’avantage unique de conservant les transmissions excitatrices et inhibitrices ¹², un aspect qui est très pertinent dans la recherche sur l’épilepsie étant donné le rôle crucial des glutamatergique et GABAergiques des réseaux dans la synchronisation épileptiforme (cf. ⁷). La 4AP-FSCA utilisé dans le présent protocole contient une concentration physiologique de K⁺ (3,25 mM) et une concentration de Mg^{2 +} légèrement plus bas que l’exploitation ACSF (1 mM contre 1,3 mM). Cette concentration relève encore les valeurs physiologiques rapportées de Mg^{2 +} concentration chez le rongeur CSF et il est utilisé dans de nombreux laboratoires (voir, par exemple,¹⁷^,¹⁸). À la fin du protocole décrit, nous avons constaté que cette légère baisse est préférée à l’aide de l’effet de 4AP.

Dans un travail antérieur, 4AP a été appliqué à la tranche de cerveau lorsqu’elle était déjà positionnée à l’intérieur de l’enregistrement chambre¹⁷^,¹⁸. À moins que l’expérimentateur doit observer la latence de temps entre l’application 4AP et l’apparition de modèles épileptiforme, nous trouvons que cette approche est plutôt chronophage et n’est pas apte à poursuivre l’enregistrement prolongé et les séances de stimulation décrites dans le présent protocole. Pré-incubation des tranches de cerveau dans 4AP à 32 ° C permet d’épargnant temps beaucoup expérimental, puisque les tranches de cerveau peuvent être pré-traitées dans la série tout en poursuivant l’expérience à l’aide d’autres coupes de tissus.

La viabilité prolongée des tranches de cerveau peut être utile d’analyser les caractéristiques du réseau à long terme. En outre, leur capacité de résistance améliorée à la stimulation électrique répétitive est un avantage si l’expérimentateur veut comparer plusieurs protocoles de stimulation, qui doivent être effectuées dans la même tranche de cerveau la robustesse statistique. Dans nos mains, lors de l’essai 3 protocoles de stimulation, chacune précédée d’une phase de contrôle et suivie d’une phase de reprise, l’expérience peut durer 3 à 5 h. Dans ce contexte, mappage direct de MEA est crucial afin d’activer la voie correcte et de réprimer plutôt que de favoriser ictogenèse via la stimulation électrique. Notre interface utilisateur conviviale représente un outil rapide, simple et flexible pour mapper les électrodes des structures cérébrales différentes. Contrairement aux logiciels commerciaux, il est possible d’ajouter des dispositions personnalisées de MEA même avec la base de compétences en programmation. Des images peuvent être acquis dans le champ lumineux ; ainsi, n’importe quelle caméra polyvalente qui comporte la bonne résolution et s’installe sur un microscope est adapté. Un microscope inversé est indispensable pour visualiser la position de microélectrodes par rapport à la tranche de cerveau, puisque ce seraient être cachés sous le tissu si vous utilisez un microscope vertical. Toutefois, un stéréo-microscope est recommandé en plus du type inversé si l’expérimentateur doit exécuter couteau-les découpes pour perturber les voies neuronales spécifiques.

Enfin, un autre avantage de l’approche proposée est l’Assemblée bon marchée et relativement facile de la plupart des outils nécessaires, comme la chambre d’enregistrement personnalisé et les chambres de l’exploitation, le bain chaud et l’ancrage de la tranche, ainsi que l’utilisation inutile d’un coûteux pompe péristaltique à faible bruit.

Limites de la Technique :

Enregistrement de MEA ne permet pas de visualiser les ondes très lentes, c’est-à-dire, DC se déplace dans le signal. Ces déviations de base peuvent aider asymptotique mesure de la durée de la décharge spontanée et, plus important encore, ils sont essentiels pour étudier la dépression propagation corticale (un phénomène qui se rapporte à la mort subite inattendue dans l’épilepsie³² et est partagé entre l’épilepsie et la migraine³³).

En ce qui concerne la neuromodulation électrique, le protocole décrit ici permet d’effectuer plusieurs séances de stimulation sans affecter la viabilité de tranches de cerveau. Nous pourrions réaliser avec succès jusqu’à 3 séances de stimulation de 20 à 45 min, semblable à ce qui indiqué dans précédents travaux²⁵. Bien que les tranches de cerveau peuvent supporter sans doute un plus grand nombre de séances de stimulation ou des protocoles de stimulation plus longues, nous n’ai pas tester des tranches de cerveau à cet égard. Nous vous recommandons de limiter le nombre de protocoles de stimulation à 3 et évitant prolongés séances de stimulation (60 min), qui peuvent exercer un stress considérablement les tissus cérébraux maintenus dans ces conditions de limite, jusqu’à l’absence de récupération après retrait du stimulus.

Étapes critiques au sein du protocole :

Plusieurs facteurs critiques susceptibles de gêner la poursuite réussie de l’enregistrement et la modulation de l’activité épileptiforme dans des tranches de cerveau couplé à MEA. Outre les espèces de rongeurs utilisés et la qualité des coupes de cerveau, le taux de perfusion lors de l’enregistrement et la dynamique de l’écoulement de l’ACSF (i.e., laminaire versus circulaire) au sein de la chambre d’enregistrement, nous avons constaté que les conditions de reprise et maintenance à long terme des tranches de cerveau ainsi que les modalités d’application de 4AP étapes sont les plus critiques.

Lorsque vous utilisez une chambre tenue submergé, il est crucial stocker les tranches de cerveau à température ambiante pour préserver l’activité cérébrale réseau des tissus et favorise l’induction des rejets ictal ressemblant par 4AP application. Dans nos mains, récupération et entretien à 32 ° C s’est détériorée au tissu cérébral dans les 3-4 h de tranchage.

Incubation du cerveau tranches au 4AP-FSCA à température ambiante et à 32 ° C est toutefois pas souhaitable. Nous avons trouvé beaucoup de difficultés dans l’observation robustes décharges ictales récurrents dans cette condition. En effet, les basses températures de l’ordre de 20 à 24 ° C ont été signalés à amortir ou même empêcher induite par la 4AP ictogenèse les deux in vitro³⁴ et in vivo³⁵. Ainsi, les températures d’incubation et enregistrement 4AP doivent se situer dans les 30-34 ° C et doivent être mis en correspondance. Pour éviter de mettre le tissu cérébral sous trop de stress en raison de l’induction simultanée d’une hyperexcitabilité de 4AP et l’exposition soudaine des tranches de cerveau depuis la température ambiante à la 4AP-FSCA chaud (32 ° C), il est fondamental d’effectuer un préchauffage intermédiaire étape et laisser que les tranches de cerveau s’habituer dans l’exploitation FSCA à 32 ° C pendant 20-30 min., sauter cette étape peuvent affecter ictogenèse induction par 4AP.

Un autre aspect qui doit être mentionné est l’importance de la concentration de D-glucose dans le FSCA après découpage. Une concentration de 25 mM préserve les tranches de cerveau mieux que la concentration de 10 mM utilisée dans de nombreux laboratoires et il améliore également le taux d’incidence de l’activité spontanée, ce qui est 2 fois plus rapide (, rendant ainsi plus facile de poursuivre une longue série d’expérimentation protocoles en plusieurs tranches de cerveau chaque jour).

Enfin, certains détails fines importants au cours de la procédure de tranchage méritent d’être mentionnés. Tout d’abord, ne pas laisser le cerveau intact et les tranches de cerveau de geler dans le froid coupant fsca. Refroidissement du cerveau pour < 2 min est suffisant compte tenu de la petite taille du cerveau de souris. Des sections de tissu doivent être transférées immédiatement de la cuve à tampon pour les béchers rinçage à température ambiante. Rincer la coupe FSCA est très important dans le cas contraire la concentration de saccharose élevé fera le cerveau tranches s’en tenir à la maille en nylon de la chambre de détention. Pour effectivement rincer le tissu, il est important de réduire au minimum le contenu de FSCA de coupe dans la pipette de transfert afin de ne pas contaminer la tenue FSCA excessivement. Le rinçage 2-stade sida en réduisant au minimum la contamination. À l’issue de la procédure de tranchage, coupes de tissus devraient être transférées immédiatement des béchers de rinçage à la chambre de détention, où le doux nylon mesh suspendu à mi-chemin dans l’exploitation FSCA permet l’oxygénation des tissus des deux côtés. Le même principe devrait s’appliquer à toutes les étapes suivant la procédure de tranchage : tranches de cerveau ne devraient jamais s’asseoir au fond du bécher, ils ne devraient pas être en contact avec les côtés des chambres holding, et ils ne doivent jamais être en contact avec eux ni se chevauchent.

Modifications et dépannage :

Composition de l’ACSF peut-être être modifiée selon les besoins de l’expérimentateur. Par exemple, médicaments peuvent être ajoutés à disséquer la contribution de neurotransmetteurs spécifiques ou des canaux ioniques à l’efficacité de la neuromodulation électrique. En outre, pyruvique et l’acide ascorbique (cf. tableau 2) peuvent être omises, même si nous trouvons qu’ils exercent un rôle neuroprotecteur puissant. Nous présentons dans le tableau 3 les questions les plus courantes que l’on peut rencontrer dans ce protocole et la façon de traiter avec eux.

Conclusions :

Enregistrement de la MEA est sans aucun doute une technique précieuse pour aborder les interactions entre les réseaux de neurones dans la santé et la maladie. En plus des études pharmacologiques, il est également possible d’évaluer les protocoles de neuromodulation électriques qui se rapportent à DBS appliqué à l’épilepsie et d’autres troubles neurologiques. Dans ce protocole, nous avons montré qu’il est possible de reproduire des expériences de stimulation périodique typique avec des résultats similaires à ceux obtenus avec les classiques domaine extracellulaire potentiels de l’enregistrement et électrodes de stimulation externe. La disponibilité croissante de l’équipement commercial convivial et des outils logiciels avancés de faire la technique d’enregistrement MEA convient également pour des expériences de stimulation de la boucle fermée, pour fournir la stimulation ad hoc pour le tissu cérébral et enquêter sur la contribution des mécanismes de rétroaction aux réponses du réseau neuronal.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

G.P. est financée par le projet d’Union européenne ACEM-IF-2014 Re.B.Us, G.A. n.660689, dans le cadre du programme cadre H2020 Marie Skłodowska-Curie Fellow. La mapMEA de GUI est disponible gratuitement sur demande à l’auteur de ilaria.colombi@iit.it.

Materials

Poly-D-Lysine	Sigma-Adrich	P7886	Needed for MEA coating
NaCl	Sigma-Adrich	S9888	Chemical
KCl	Sigma-Adrich	P9541	Chemical
KH₂PO₄	Sigma-Adrich	795488	Chemical
CaCl₂*2 H₂O	Sigma-Adrich	C3306	Chemical
D-Glucose	Sigma-Adrich	RDD016	Chemical
NaHCO₃	Sigma-Adrich	S5761	Chemical
MgCl₂*6 H₂O	Sigma-Adrich	M2670	Chemical
MgSO₄*6 H₂O	Sigma-Adrich	M5921	Chemical
Sucrose	Sigma-Adrich	RDD023	Chemical
Pyruvic Acid, 98%	Sigma-Adrich	107360	Chemical
4-aminopyridine	Sigma-Adrich	A78403	Convulsant drug
STG-2004	Multichannel System	STG4004-1.6mA	4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA)
MEA1060	Multichannel System	N/A	MEA amplifier
planar MEA	Multichannel System	60MEA500/30iR-Ti w/o ring	Must be without ring to allow using the custom recordingchamber
McRack	Multichannel System		Recording software
McStimulus II	Multichannel System		STG4004 control software
TC02	Multichannel System	TC02	2-channel thermostat
PH01	Multichannel System	PH01	Heating perfusion canula
MPH	Multichannel System	MPH	Magnetic holder for PH01 and suction needle
Elastostil E43	Wacker	E43	Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA
MEA Custom Chamber	Crisel Instrument	SKE-chamber MEA	Custom recording chamber
Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm	Crisel Instrument	64-1309	Reference electrode for the custom recording chamber
Tergazyme	Sigma-Adrich	Z273287-1EA	Enzymatic cleaner
MATLAB	The Mathworks		Programming environment for electrodemapping
VT1000S	Leica Biosystems	VT1000S	Vibratome
	Warner Instruments	64-1309	Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode.

References

Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
WHO. . Epilepsy Facts Sheet. , (2017).
Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
Dingledine, R. . Brain slices. , (1984).
Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
Pitkanen, A. . Models of seizures and epilepsy. , (2017).
Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
MultichannelSystems. . Manual PH01. , (2018).
Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
D’Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
MA, R., Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A. . Jasper’s Basic Mechanisms of the Epilepsies . , (2012).
Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Panuccio, G., Colombi, I., Chiappalone, M. Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (135), e57548, doi:10.3791/57548 (2018).

Automatically Generated