تسجيل وتعديل النشاط صرعية في الدماغ القوارض شرائح بالإضافة إلى صفائف ميكروليكترودي
Summary
نحن لتوضيح كيفية إجراء تعديل التسجيل والكهربائية النشاط الناجم عن 4-أمينوبيريديني صرعية في الدماغ القوارض الشرائح باستخدام صفائف ميكرويليكترودي. وتحتفظ دائرة تسجيل مخصص صلاحية الأنسجة طوال دورات تجريبية طويلة. يعيش القطب رسم الخرائط واختيار أزواج حفز يؤديها واجهة مستخدم رسومية مخصصة.
Abstract
صرع الفص الصدغي (TLE) هو مرض الصرع المعقدة الجزئية الأكثر شيوعاً وأقل استجابة للأدوية. تحفيز الدماغ العميق (DBS) نهج واعدة عند فشل العلاج الدوائي أو لا يوصي بجراحه الأعصاب. شرائح الدماغ الحادة بالإضافة إلى ميكروليكترودي صفائف (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) تمثل أداة قيمة لدراسة التفاعلات شبكة الخلايا العصبية والتحوير واسطة التحفيز الكهربائي. مقارنة بتقنيات تسجيل خارج الخلية التقليدية، وأنها توفر مزايا إضافة عدد أكبر من نقاط المراقبة ومسافة بين قطب معروفة، والتي تسمح لدراسة مسار الدعوة وسرعة الكهربية الإشارات. ومع ذلك، قد يكون الأوكسجين الأنسجة تضعف إلى حد كبير أثناء طيران الشرق الأوسط تسجيل، والتي تتطلب معدل التروية عالية، والتي تأتي على حساب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وذبذبات أعلى في درجة حرارة التجريبية. التحفيز الكهربائي كذلك تشدد على أنسجة المخ، مما يجعل من الصعب متابعة التسجيل المطول/التحفيز الأزمان. وعلاوة على ذلك، يحتاج التحوير الكهربائية لنشاط الدماغ شريحة لاستهداف الهياكل/مسارات محددة ضمن شريحة الدماغ، التي تتطلب أن قطب كهربائي يمكن بسهولة وسرعة تنفيذ التعيين لايف خلال التجربة. نحن هنا، لتوضيح كيفية إجراء تعديل التسجيل والكهربائية من 4-أمينوبيريديني (4AP)-التي يسببها النشاط صرعية في الدماغ القوارض الشرائح باستخدام مستو الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. نظهر أن أنسجة المخ التي تم الحصول عليها من الفئران يتفوق أنسجة المخ الفئران، وهكذا أكثر ملاءمة لتجارب طيران الشرق الأوسط. ويضمن هذا البروتوكول الاستمرار في توليد والحفاظ على نمط مستقر صرعية إخلاص يستنسخ الميزات الكهربية لاحظ مع تسجيل المحتملة في الميدان التقليدي، واستمرت لعدة ساعات، وأووتلاستس التحفيز الكهربائي لفترات طويلة. صلاحية الأنسجة في جميع أنحاء التجربة يتحقق بفضل استخدام دائرة تسجيل مخصص صغيرة الحجم مما يتيح معدلات التروية الاندفاق الصفحي وتبادل الحلول السريعة حتى في منخفض (1 مل/دقيقة). تعيين شركة طيران الشرق الأوسط سريعة للرصد في الوقت الحقيقي والتحديد لتحفيز كهربائي يقوم بواجهة مستخدم مخصصة رسومات (GUI).
Introduction
الصرع اضطراب تقدمية مهددة للحياة تسبب النشاط غير المنضبط ل الدماغ1؛ وهو يحمل بين أعلى عبء المرض والوصمة الاجتماعية الهامة2،3. TLE هو متلازمة الأكثر شيوعاً (40 ٪) والأكثر في كثير من الأحيان (~ 30 ٪) مقاومة للأدوية المضادة للصرع4. بينما يمكن تحسين الاستئصال الجراحي للأنسجة ابيليبتوجينيك حالة المريض، ليس ممكناً في جميع المرضى وقد لا تضمن حياة خالية تماما من الاستيلاء على5. التحوير للصرع الشبكات الكهربائية DBS الحوفي نهج واعدة عند العلاج الدوائي أو جراحة الأعصاب ليست مناسبة.
شرائح الدماغ القوارض أداة قيمة لدراسة وظيفة الشبكات العصبية كيف في الصحة والمرض6 عن طريق تقنيات في المختبر الكهربية، كما أنهم الاحتفاظ، على الأقل في جزء الهندسة المعمارية والربط في الدماغ الأصلي region(s) للفائدة (العائد على الاستثمار). على وجه الخصوص، الحصين مجتمعة الأفقية-انتورهينال اللحاء (الحصين-EC) شرائح تشمل الشبكات العصبية الأساسية المشتركة في TLE ولذلك تستخدم بشكل روتيني في المختبر TLE البحث7.
قد يتسبب نشاط مثل الاستيلاء حادة في شرائح المخ بتغيير تكوين السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام)، مثل انخفاض المغنيسيوم مع زيادة البوتاسيوم8،،من910، الأيونية أو عن طريق التلاعب الدوائية، مثل حظر المثبطة جابايرجيك النشاط (انظر11 لإجراء استعراض شامل). ومع ذلك، هذه النماذج تستند إلى تحوير غير متوازن من الإثارة وتثبيط؛ وهكذا، لا تسمح دراسة تفاعل وتضافر مساهمة الشبكات عليه والمثبطة إيكتوجينيسيس. يحسن التروية المستمرة من شرائح المخ مع 4AP المخدرات الاختلاج كبيرة عليه والمثبطة على حد سواء، مما يسمح بدراسة إيكتوجينيسيس الحاد مع إبقاء نشاط متشابك عموما سليمة12.
الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف السماح لتسجيل النشاط الكهربائي إنشاؤها بواسطة الشبكات العصبية من عدد أكبر من نقاط المراقبة بالمقارنة مع تسجيل الحقل خارج الخلية التقليدية المحتملة، حيث تحد القيود المكانية عدد الأقطاب الكهربائية التي يمكن أن تكون إيواء على سطح شريحة الدماغ. وعلاوة على ذلك، رقائق طيران الشرق الأوسط توفر ميزة إضافية من المعروفة بين القطب المسافة، وهو أمر مفيد جداً لنشر تتبع وتقييم سرعة السفر من الإشارات المسجلة. على الرغم من أن تصور في البداية للتسجيل من الخلايا العصبية مثقف13،14، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف الآن تستخدم أيضا لوصف الميزات الكهربية من شرائح المخ الحادة التي تم الحصول عليها من القوارض15 والبشر16. وهكذا، في سياق البحوث الصرع، الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف تمثل أداة قيمة لتحديد التفاعلات الشبكات العصبية في صميم إيكتوجينيسيس16،،من1718.
ومع ذلك، يحمل تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط أصلاً التحديات التقنية في الحصول على أو المحافظة على نمط صرعية مستقرة في جميع أنحاء البروتوكولات التجريبية منذ فترة طويلة (عدة ساعات). أولاً، الأوكسجين الأنسجة قد لا تكون كافية داخل الكبيرة والجولة تسجيل نوع أغرقت الدائرة19،20 النموذجية المتاحة تجارياً الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، في حين قد تؤثر على نسبة الإشارة إلى الضوضاء الفقراء وعدم استقرار درجة الحرارة جودة التسجيل عندما يتم استخدام معدل التروية عالية (6-10 مل/دقيقة) لتحسين إمدادات الأكسجين بشريحة الدماغ (انظر على سبيل المثال الملاحظات التقنية على معدات التدفئة ونضح21). التصريفات المتكررة، والثاني يضم المكونات ذات تردد عال، مثل التصريفات صرعية، لا يكاد يلاحظ عند استخدام تسجيل نوع المغمورة الدوائر19؛ هذا هو الحال بصفة خاصة عندما نمط صرعية الحادة هي التي يسببها كيميائيا وينطوي على آليات افابتيك، كما هو الحال بالنسبة لنموذج 4AP22 (انظر11 لنظره شاملة). للتغلب على هذه القيود، اقترحت عدة استراتيجيات للباحثين. على سبيل المثال، زيادة في معدل التروية19،20 مع تقليل سمك شريحة الدماغ (دي ثري زيرو زيرو ميكرومتر) ومنطقة،من1718 عوامل حاسمة في تحقيق إمدادات الأكسجين الكافي للأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تحقيق صلاحية شريحة الدماغ تحسين باستخدام مثقب الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف (بمياس)، التي تسمح بيرفوسينج أنسجة المخ من كلا الجانبين18.
بينما وصف النهج التي تحسنت كثيرا إمكانية تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط من شرائح المخ، أنهم لم يتم اختبارها ضد لفترات طويلة (عدة ساعات) دورات تنشيط التسجيل والكهربائية، تمثل هذه الأخيرة كبيرة الإجهاد لانسجة المخ. قد يلزم دورات التسجيل المطول لدراسة التطور في الوقت المناسب سمات المحددة لأنماط صرعية أن عدم التمكن من كشف بالقياسات القصيرة الأجل. قد يلزم في سياق البحوث DBS، البروتوكولات التجريبية المطول لتقييم ومقارنة آثار عدة نماذج التحفيز في شريحة الدماغ نفسه.
عندما يحتاج فقط النشاط الكهربائي العفوية التي سيتم تسجيلها، رسم الخرائط من أقطاب فيما يتعلق بالعائد على الاستثمار عادة ما يتم اللاحق، أيأثناء تحليل البيانات؛ بدلاً من ذلك، يتطلب دراسة الاستجابات مقولة أو نماذج neuromodulation الكهربائية أن التحفيز تسليمها إلى ROI(s) محددة، يملي ضرورة تعيين مسرى حية سهلة وسريعة أثناء التجربة.
وهنا، نحن توضيح بروتوكول تجريبي بسيط يسمح للاستقراء والحفاظ على نمط مستقر صرعية 4AP المستحثة في شرائح الدماغ القوارض الكبار. النشاط الملاحظ إخلاص يستنسخ الكهربية ميزات هذا الطراز كما يتميز باستخدام التقنيات التقليدية خارج الخلية الكهربية. أنها استمرت لعدة ساعات وأووتلاستس التحفيز الكهربائي المتواصل للعهود الطويلة المتكررة. الدوائر المستخدمة للحفاظ على واحتضان الشرائح المخ يمكن بسهولة تجميع باستخدام اللوازم المختبرية القياسية (الشكل 1A)، بينما يمكن دائرة تسجيل مخصص يسمح لسعر الصرف الحل الأمثل وتدفق الصفحي (الشكل 1B) يمكن الحصول عليها من مصادر تجارية أو باستخدام تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد بسعر في متناول. تعيين سريعة من ROI(s) للرصد في الوقت الحقيقي واختيار أقطاب محفزة بفضل واجهة المستخدم الرسومية سهلة الاستخدام مخصص المسمى مابميا، متاحة عند الطلب.
رقم 1: معدات مخصصة تستخدم هذا البروتوكول. (أ) عقد الدوائر للإنعاش وقبل الاحترار، ومرحلة ما قبل الاحتضان في 4AP يتم تجميعها باستخدام كوب وطبق بيتري. يجب أن تكون أقل في القطر قواطع طبق بيتري ويقام في مكان عن طريق المكبس المحاقن. يتم استبدال الجزء السفلي من صحن بيتري شبكة نايلون (من جوارب ناعمة) لاصق مع cyanoacrylate على حافة الطبق بيتري. يتم توفير الأوكسجين عن طريق إبرة العمود الفقري بنت (22 ز)، تدخل بين جدران صحن بتري والكأس. وينبغي أن الناشئة فقاعات من جانب الكأس والوصول إلى شبكة النايلون لتجنب تشريد شريحة الدماغ ابدأ. يمكن استخدام الجزء العلوي من طبق بيتري كغطاء لتجنب التبخر قام والحفاظ على تشبع الأكسجين. (ب) دائرة تسجيل مخصص. في: مدخل الخزان لاستيعاب قنية تدفئة ومسرى مرجع. بها: منفذ خزان لاستيعاب إبرة الشفط. تفصيل: تسجيل الدائرة. ماصة “باستور” (ج) الزجاج، كرة لولبية من الحريق وتلميع، تستخدم للتعامل مع الأنسجة وتعديل موقفها داخل قاعة تسجيل. الربط هولددوون شريحة مخصصة (د). (ﻫ) التجميع النهائي لدائرة تسجيل المركبة على رقاقة شركة طيران الشرق الأوسط. شريحة الدماغ تقع على الجزء السفلي الذي عقد في مكان بالمرساة. السهم الأحمر يشير إلى الأنبوب PTFE تغطي قنية التدفئة، بينما تشير الدائرة الحمراء إلى مسرى مرجع، بيليه بوكل مشبعة المغمورة التي قام في مدخل الخزان. السهم الأزرق يشير إلى إبرة شفط في الخزان منفذاً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
Representative Results
Discussion
الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف هي أداة لا تقدر بثمن للتحقيقات العصبية، وقد وصلت إلى مرحلة النضج في السنوات الأخيرة بفضل عقود الاستكشاف والتنمية. مقارنة بتسجيل الحقل التقليدية المحتملة، وتوفر الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف والميزة الكبرى لعدد أكبر من نقاط المراقبة، والمسافة بين القطب المعروفة، التي تعتبر حاسمة بالنسبة لدقة تحديد التفاعلات شبكة الخلايا العصبية.
يمكن أيضا إضافة تقنية لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط إلى النهج الكهربية الأخرى، مثل المشبك التصحيح تسجيل15، للتحقيق في العلاقة بين نشاط شبكة الخلايا العصبية والخلايا العصبية وحيدة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن توفر إمكانية تصور الإمكانات الميدانية والنشاط وحدة متعددة في نفس الوقت رؤى الثمينة في العلاقة بين نشاط الفرق الصغيرة الخلايا العصبية والشبكات العصبية الجماعية. المزيج مع الأصباغ المراعية للجهد وتصوير الكالسيوم أوبتوجينيتيكس29 يسمح استنتاج الظواهر العصبية باستخدام النهج بوليهيدرال. بالإضافة إلى الدراسات الدوائية، يجعل إمكانية القيام بتسجيل والتحفيز مع نفس النظام تقنية لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط تنوعاً وقوية للغاية: فعلى سبيل المثال، من الممكن لدراسة الظواهر اللدونة متشابك في لب الذاكرة تشكيل30، استخدام بروتوكولات neuromodulation المعروضة هنا، التي ذات الصلة إلى DBS لعلاج الصرع، ومجموعة متنوعة من اضطرابات الدماغ. الأخيرة دليل على أن تقنية تسجيل اتفاق بيئي متعدد الأطراف يمكن تطبيقها بنجاح على أنسجة المخ الصرع البشرية16 يوضح فائدتها لا تقدر بثمن في الصرع للبحث، على حد سواء لفهم الآليات الأساسية الكامنة وراء هذا المرض المدمر وأن ضبط خوارزميات DBS التخفيف من ذلك.
بيد قوة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف السعي إلى التجارب الكهربية تحت ظروف ‘تحد’ لشرائح المخ، بسبب اشتراط دائرة تسجيل المغمورة، وضرورة السماح للدماغ شريحة باقي على الركازة الصلبة حيث الصغرى-أقطاب كهربائية وقد أدمجت. وبالتالي، قد لا تتلقى أنسجة المخ إمدادات الأكسجين الكافي، مما قد يؤثر بدوره على جودة التسجيلات.
يسمح البروتوكول الموصوفة هنا سجل موثوق بها، ودراسة إيكتوجينيسيس في شبكات الحوفي القوارض بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف باستخدام نموذج 4AP الأنبوبي الحاد ومتابعة الحقبات الطويلة للتحفيز الكهربائي، التي توفر المعلومات ذات الصلة لتقييم DBS السياسات.
استخدمت الدراسات السابقة في نيورومودوليشن الكهربائية شبكات الحوفي الصرع استناداً إلى استخدام تسجيل المحتملة في الميدان التقليدي لشرائح المخ الفأر أو الجرذ مع نتائج مماثلة24،25؛ ولكن استخدام أنسجة المخ الفئران أثبتت أنها أكثر تحديا، معقول بسبب اتصال أضعف بالمقارنة مع أنسجة الدماغ التي تم الحصول عليها من الفئران7. فيما يتعلق بأسلوب اتفاق بيئي متعدد الأطراف، شرائح المخ الماوس الأنسب بحكم صغر حجمها. وعلاوة على ذلك، نظراً لارتفاع معدل حدوث إيكتال مثل التصريفات في الماوس مقابل أنسجة المخ الفئران، فمن الممكن لاختبار شرائح المخ أكثر بشكل ملحوظ طوال يوم التجريبي، الذي بدوره يجعل جمع البيانات أسرع وأكثر كفاءة، ويمكن خفض عدد الحيوانات المستخدمة.
أهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة:
تصريفات ictal تسجيلها باستخدام الدائرة المخصصة الموصوفة هنا يبدو مماثلة في المدة ومعدل الحدوث لتلك التي لوحظت في استخدام قاعة خاتم شركة طيران الشرق الأوسط التقليدية ونفس نوع اتفاق بيئي متعدد الأطراف (أقطاب الصغرى مستو، قارن 17). ومع ذلك، فإنه يلزم التشديد على أن سماكة شريحة الدماغ يجب أن تخفض إلى حد كبير عند استخدام قاعة تسجيل جولة التقليدية جنبا إلى جنب مع معدل انخفاض التروية (1 مل/دقيقة)، التي قد تعوق السعي الناجح إلى neuromodulation التجارب الواجب للاتصال بالفقراء.
في هذا البروتوكول، تقدم دائرة تسجيل مخصص الحجم المنخفض مستوحاة من تصميم غرفة تسجيل التصحيح-المشبك الاندفاق الصفحي مستقر وموثوق بها أمر بالغ الأهمية لتحقيق نجاح تسجيلات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف؛ كما أنه يتيح زيادة سماكة شريحة الدماغ إلى 400 ميكرون بغية تحقيق الموازنة عادلة بين صلاحية الأنسجة والربط الجوهرية. من المسلم به في الواقع هذا التدفق الصفحي الحل تسجيل داخل الدائرة مرغوب فيه للغاية لشريحة الدماغ الكهربية، نظراً لأنها لا تتأثر بدرجة الحرارة، والأكسجين، والتدرجات درجة الحموضة التي لوحظت في تدفق دائري الجولة تسجيل الدوائر20،،من1931 (مثل تلك التي قدمت مع الشرق الأوسط وأفريقيا متوفرة تجارياً). إدخال التحيز التجريبية مثل التدرجات وتضر أيضا بشريحة الدماغ. دوائر تسجيل كمية صغيرة نسبيا (مل ~1.5) جنبا إلى جنب مع نضح ارتفاع معدل (5-6 مل/دقيقة)16،31 يسمح بتبادل المتوسطة نضح كاف (إيه ثري مرات/دقيقة). قاعة مخصصة يمكن بسهولة الحصول عليها من مصادر تجارية بسعر في متناول أو المنتجة داخليا باستخدام تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد. وأفادت الدراسات الأخرى تسجيلات شركة طيران الشرق الأوسط من الدماغ البشري ميكرومتر سميكة 400 شرائح16 استخدام قاعة خاتم شركة طيران الشرق الأوسط التقليدية، مع إبقاء حجم قام إلى 1 مل وإنفاذها بمعدل التروية عالية (5-6 مل/دقيقة) بمساعدة مضخة تمعجية منخفضة الضوضاء. ومع ذلك، استخدمت المؤلفون نموذجا مختلفاً من إيكتوجينيسيس، أي، انخفاض Mg2 +، التي من المرجح أن تتأثر أقل من طراز 4AP بالآليات افابتيك التي تنطوي على زيادات كبيرة في تركيز ك+ خارج الخلية 11 , 22-وقد وجدنا أن نسبة عالية من نضح غير مرغوب فيه في نموذج 4AP، ربما بسبب الغسيل السريع خارج كخارج الخلية المتراكمة+، التي قد تحتاج إلى زيادة كبيرة في التسجيل قام16. وفي الواقع، الأحداث ictal ظهرت أكثر ‘المقسم’ عندما زادت سرعة نضح المهرجان إلى 2-3 مل/دقيقة وشريحة الدماغ كانت مغمورة بطبقة سميكة من قام، بينما يمكن استعادة كاملة التصريفات نستعرض مكونات منشط بهلوانية قوية لدى عودته إلى انخفاض معدل التروية (1 مل/دقيقة) وقام أرق طبقة حق على مستوى الأنسجة السطحية (البيانات لا تظهر). قاعة تسجيل مخصص الموصوفة في هذا البروتوكول يتيح تبادل المتوسطة نضح 3-5 مرات/دقيقة بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة. وهكذا، بقوة تحسين إمدادات الأكسجين عموما إلى شرائح المخ حتى في معدلات التروية منخفضة نسبيا، بينما لا يزال ضمان مستقر تسجيل درجة الحرارة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية. الأهم من ذلك، فمن الممكن للحفاظ على تركيز ك+ خارج الخلية إلى قيمة فسيولوجية.
نموذج 4AP إيكتوجينيسيس لا يتطلب أي تعديل كبير في تكوين قام الأيونية، مثل ملغ خفض2 + أو زيادة ك+، ويوفر ميزة فريدة من نوعها للمساس الإرسال عليه والمثبطة على حد سواء 12، أحد جوانب التي ترتبط ارتباطاً وثيقا بالصرع للبحث في ضوء الدور الحاسم لكل من جلوتاماتيرجيك والشبكات جابايرجيك في المزامنة صرعية (انظر 7). 4AP-قام المستخدمة في هذا البروتوكول يحتوي على تركيز ك+ فسيولوجية (3.25 ملم) وملغ2 + تركيز أقل قليلاً من عقد قام (1 مم مقابل 1.3 ملم). هذا التركيز لا يزال يندرج ضمن القيم المبلغ عنها الفسيولوجية Mg2 + التركيز في مكافحة القوارض السائل الدماغي النخاعي، ويتم استخدامه في العديد من المختبرات (انظر على سبيل المثال17،18). أن غرض البروتوكول هو موضح، وجدنا أن هذا الانخفاض الطفيف هو المفضل للمعونة في أثر 4AP.
في الأعمال السابقة، طبق 4AP بشريحة الدماغ عند أنه تم فعلا المتمركزة داخل ال17،الدائرة تسجيل18. إلا المجرب يحتاج إلى مراقبة الكمون الوقت بين تطبيق 4AP وظهور أنماط صرعية، نجد أن هذا النهج مضيعة للوقت وليست مناسبة لمتابعة التسجيل المطول ودورات التحفيز المبينة في هذا البروتوكول. الحضانة قبل شرائح المخ في 4AP عند 32 درجة مئوية يسمح تدخر الوقت كثير التجريبية، يمكن أن تكون شرائح المخ ما قبل المعالجة في سلسلة مع السعي إلى تحقيق التجربة باستخدام مقاطع الأنسجة الأخرى.
صلاحية مدة طويلة من شرائح المخ قد تكون مفيدة لتحليل ميزات الشبكة على المدى الطويل. وعلاوة على ذلك، مرونتها محسنة للتحفيز الكهربائي المتكرر لميزة كبيرة إذا كان يريد المجرب لمقارنة عدة بروتوكولات التحفيز، الذي يجب أن يتم في نفس شريحة الدماغ لمتانة الإحصائية. في أيدينا، عند اختبار 3 تحفيز البروتوكولات، كل تسبقها مرحلة مراقبة وتليها مرحلة انتعاش، قد تستمر التجربة ح 3-5. وفي هذا السياق، يعيش طيران الشرق الأوسط التعيين بالغ الأهمية من أجل تنشيط المسار الصحيح وقمع بدلاً من إيكتوجينيسيس عن طريق التحفيز الكهربائي لصالح. لدينا سهلة الاستخدام واجهة المستخدم الرسومية يمثل أداة سريعة وبسيطة ومرنة لخريطة أقطاب هياكل الدماغ المختلفة. خلافا للبرمجيات التجارية، فمن الممكن لإضافة تخطيطات مخصصة من شركة طيران الشرق الأوسط حتى مع مهارات البرمجة الأساسية. يمكن الحصول على الصور في حقل مشرق؛ وهكذا، أي الكاميرا للأغراض العامة بقرار جيد ويناسب على مجهر مناسبة. مجهر مقلوب ضروري لتصور موقف ميكروليكتروديس بالنسبة لشريحة الدماغ، منذ هذه سوف تكون مخفية تحت الأنسجة إذا كان استخدام مجهر تستقيم. مع ذلك، ينصح ستيريو-مجهر بالإضافة إلى نوع مقلوب إذا المجرب يحتاج إلى إجراء تخفيضات سكين لتعطيل مسارات الخلايا العصبية المحددة.
أخيرا، ثمة ميزة أخرى للنهج المقترح هو تجميع معظم الأدوات اللازمة، مثل قاعة تسجيل مخصص والدوائر القابضة، وحمام دافئ ومرساة شريحة، فضلا عن استخدام لا لزوم لها تكلفة رخيصة وسهلة نسبيا مضخة تمعجية منخفضة الضوضاء.
القيود المفروضة على هذه التقنية:
تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط لا تسمح بتصور موجات بطيئة جداً، أي، DC تحولات في الإشارة. قد تساعد هذه الانحرافات الأساس قياس مقارب لمدة التفريغ ictal، والأكثر أهمية، أساسية لدراسة الاكتئاب نشر القشرية (ظاهرة تتعلق بالوفاة المفاجئة غير المتوقعة في الصرع32 ومشتركة بين الصرع والصداع النصفي33).
فيما يتعلق نيورومودولاتيون الكهربائية، يسمح بروتوكول الموصوفة هنا إجراء عدة دورات التحفيز دون التأثير على بقاء شريحة الدماغ. ويمكن أن نقوم بنجاح يصل إلى 3 دورات التحفيز من 20-45 دقيقة، مماثلة لما ذكر في السابق العمل25. على الرغم من أن قد تحمل شرائح المخ ربما عدد أكبر من دورات التحفيز أو بروتوكولات تحفيز أطول، ونحن لا اختبار شرائح المخ في هذا الصدد. نحن نوصي بالحد من عدد البروتوكولات التحفيز على 3 وتجنب إطالة دورات التحفيز (إيه سيكس زيرو دقيقة)، الذي قد يؤكد إلى حد كبير أنسجة المخ الاحتفاظ بها ضمن هذه الشروط الحد، حتى عدم الاسترداد عند سحب الحافز.
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول:
وقد تعوق العديد من العوامل الحاسمة السعي الناجح إلى تسجيل وتعديل النشاط صرعية في الدماغ شرائح بالإضافة إلى الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. وإلى جانب أنواع القوارض المستخدمة ونوعية الشرائح المخ، ومعدل التروية أثناء التسجيل وديناميات تدفق قام (أي., الصفحي مقابل التعميم) داخل قاعة تسجيل، وجدنا أن ظروف الانتعاش و الصيانة على المدى الطويل من شرائح المخ وكذلك طريقة تطبيق 4AP هي الخطوات الأكثر أهمية.
عند استخدام دائرة عقد مغمورة من الأهمية بمكان لتخزين شرائح المخ في درجة حرارة الغرفة الحفاظ على نشاط شبكة أنسجة المخ وصالح تقلد ictal مثل التصريفات قبل تطبيق 4AP. في أيدينا، تدهورت الانتعاش والصيانة عند 32 درجة مئوية أنسجة المخ داخل ح 3-4 من التقطيع.
شرائح الحضانة للدماغ في 4AP-قام في درجة حرارة الغرفة والتسجيل على 32 درجة مئوية، ومع ذلك، غير مرغوب فيه. وقد وجدنا العديد من الصعوبات في مراقبة قوية من التصريفات ictal المتكررة في هذا الشرط. في الواقع، أبلغ عن انخفاض درجات الحرارة في حدود 20-24 درجة مئوية إخماد أو حتى منع المستحثة 4AP إيكتوجينيسيس على حد سواء في المختبر34 و في فيفو35. وهكذا، 4AP الاحتضان وتسجيل درجات الحرارة يجب أن تندرج 30-34 درجة مئوية، ويجب أن تكون مطابقة. لتجنب وضع أنسجة المخ تحت الكثير من الضغط بسبب تحريض متزامنة من hyperexcitability 4AP والتعرض المفاجئ من شرائح المخ من درجة حرارة الغرفة إلى الحارة (32 درجة مئوية) 4AP-قام، أساسي لأداء وسيطة قبل الاحترار الخطوة واسمحوا روض الشرائح الدماغ في عقد قام عند 32 درجة مئوية عن 20-30 دقيقة تخطي هذه الخطوة قد تؤثر على تحريض إيكتوجينيسيس من 4AP.
هو الجانب الآخر الذي يحتاج إلى ذكر أهمية تركيز د-الجلوكوز في قام بعد تشريح. يحتفظ بتركيز 25 مم شرائح الدماغ أفضل من تركيز 10 ملم المستخدمة في العديد من المختبرات ويحسن أيضا أن معدل حدوث النشاط ictal، وإضعاف أسرع (وهكذا، مما يجعل من الأسهل متابعة سلسلة طويلة من التجريبية البروتوكولات في عدة شرائح الدماغ كل يوم).
وأخيراً، تحتاج بعض التفاصيل الدقيقة الهامة أثناء إجراء تشريح الجدير بالذكر. أولاً، لا تسمح الدماغ سليمة وشرائح المخ لتجميد في البرد قطع قام. تقشعر لها اﻷبدان في الدماغ < 2 دقيقة بما يكفي نظراً لصغر حجم الدماغ الماوس. ينبغي نقل أقسام الأنسجة مباشرة من علبة المخزن المؤقت لقنينة الشطف في درجة حرارة الغرفة. الشطف القطع قام من المهم جداً إلا تركيز السكروز عالية سوف تجعل الدماغ شرائح التمسك بشبكة نايلون من قاعة عقد. فعالية شطف الأنسجة، من المهم تقليل محتوى قام قطع داخل ماصة نقل كي لا يلوث عقد قام مفرطة. 2-مرحلة الإيدز الشطف في التقليل من التلوث. عند انتهاء إجراء تشريح، أقسام الأنسجة ينبغي نقل فورا من قنينة الشطف إلى قاعة عقد، حيث النايلون لينة مش معلقة في منتصف الطريق في عقد قام يسمح الأوكسجين الأنسجة على كلا الجانبين. ينبغي تطبيق نفس المبدأ في جميع مراحل بعد إجراء تشريح: شرائح المخ ينبغي أن تجلس ابدأ في الجزء السفلي من الكأس، لا ينبغي أن تكون على اتصال مع الجانبين لعقد الدوائر، وينبغي ابدأ أن تكون على اتصال ببعضهم البعض ولا التداخل.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
قد يتم تعديل تكوين قام وفقا لاحتياجات المجرب. على سبيل المثال، يمكن إضافة الأدوية تشريح مساهمة محددة العصبية أو قنوات أيون بفعالية نيورومودوليشن الكهربائية. وعلاوة على ذلك، بيروفك وحمض الأسكوربيك (انظر الجدول 2) قد حذف، على الرغم من أننا نجد أنها تمارس دوراً محصن قوية. ونحن التقرير في الجدول 3 القضايا الأكثر شيوعاً التي يمكن أن تصادف في هذا البروتوكول وكيفية التعامل معها.
الاستنتاجات:
تسجيل شركة طيران الشرق الأوسط بلا شك أسلوب لا تقدر بثمن لمعالجة التفاعلات بين الشبكات العصبية في الصحة والمرض. بالإضافة إلى الدراسات الدوائية، ومن الممكن أيضا لتقييم البروتوكولات neuromodulation الكهربائية ذات الصلة ب DBS المطبقة للصرع وغيره من الاضطرابات العصبية. في هذا البروتوكول، وقد أظهرنا أنه من الممكن استنساخ التجارب النموذجية التحفيز الدوري مع نتائج مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها مع تسجيل الحقل خارج الخلية التقليدية المحتملة وتحفيز كهربائي خارجي. زيادة توافر معدات سهلة الاستعمال التجاري وأدوات البرامج المتقدمة تجعل تقنية لتسجيل شركة طيران الشرق الأوسط مناسبة أيضا لتجارب التحفيز حلقة مغلقة، لتوفير التحفيز المخصصة لانسجة المخ، التحقيق مساهمة آليات التغذية المرتدة إلى استجابات شبكة الخلايا العصبية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
سباق الجائزة الكبرى هو زميل كوري Skłodowska ماري يموله “الاتحاد الأوروبي” مسكاً-لو-2014 المشروع Re.B.Us، G.A. n.660689، ضمن إطار برنامج “أفق 2020”. مابميا واجهة المستخدم الرسومية متاحة بحرية بناء على طلبها للكاتب ilaria.colombi@iit.it.
Materials
| Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
| NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
| KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
| KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
| CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
| D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
| NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
| MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
| MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
| Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
| 4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
| STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
| MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
| planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
| McRack | Multichannel System | Recording software | |
| McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
| TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
| PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
| MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
| Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
| MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
| Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
| MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
| VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
| Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |
References
- Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
- WHO. . Epilepsy Facts Sheet. , (2017).
- Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
- Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
- Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
- Dingledine, R. . Brain slices. , (1984).
- Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
- Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
- Pitkanen, A. . Models of seizures and epilepsy. , (2017).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
- Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
- Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
- Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
- MultichannelSystems. . Manual PH01. , (2018).
- Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
- Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
- Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
- Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
- D’Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
- Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
- Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
- Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
- MA, R., Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A. . Jasper’s Basic Mechanisms of the Epilepsies . , (2012).
- Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
- Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).
