Gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor acoplado para matrizes de microeletrodos
Summary
Ilustramos como executar gravação e elétrica de modulação da atividade epileptiforme 4-aminopiridina-induzida em fatias de cérebro de roedor usando matrizes de microeletrodos. Uma câmara de gravação personalizada mantém a viabilidade do tecido durante prolongadas sessões experimentais. Viver o mapeamento de eletrodo e seleção de pares estimulantes são executadas por uma interface de usuário gráfica personalizada.
Abstract
Epilepsia do lobo temporal (TLE) é a mais comum síndrome epiléptica complexa parcial e o menos responsivos às medicações. Estimulação cerebral profunda (DBS) é uma abordagem promissora quando falha de tratamento farmacológico ou neurocirurgia não é recomendada. Fatias de cérebro aguda acopladas para matrizes de microeletrodos (MEAs) representam uma ferramenta valiosa para estudar as interações de rede neuronal e sua modulação por estimulação elétrica. Em comparação com as técnicas convencionais de gravação extracelular, eles fornecem as vantagens de um maior número de pontos de observação e uma distância conhecida de eletrodo inter, que permitem estudar o caminho de propagação e velocidade da eletrofisiológicos sinais. No entanto, oxigenação dos tecidos pode ser grandemente prejudicada durante MEA gravação, que requerem uma taxa alta de perfusão, que vem à custa da diminuição da relação sinal-ruído e maiores oscilações na temperatura experimental. Estimulação elétrica mais salienta o tecido cerebral, dificultando a perseguir épocas de gravação/estimulação prolongada. Além disso, elétrica modulação da atividade de fatia cerebral precisa de estruturas/percursos específicos dentro da fatia de cérebro, exigindo que o mapeamento de eletrodo ser facilmente e rapidamente tocada ao vivo durante o experimento de destino. Aqui, ilustramos como executar a modulação de gravação e elétrica de 4-aminopiridina (4AP)-induzido atividade epileptiforme em fatias de cérebro de roedor usando MEAs planares. Nós mostramos que o tecido cerebral obtido de ratos supera o tecido de cérebro de rato e, portanto, é mais adequado para experimentos MEA. Este protocolo garante a geração e manutenção de um padrão estável epileptiforme fielmente reproduz as características eletrofisiológicas observadas com gravação potenciais de campo convencional, persiste por várias horas e sobrevive à sustentada estimulação elétrica para épocas de prolongada. Viabilidade de tecido em todo o experimento é alcançada graças à utilização de uma câmara de pequeno volume de gravação personalizada, permitindo fluxo laminar e troca de solução rápida, mesmo em baixa (1 mL/min) taxas de perfusão. Mapeamento de MEA rápido para monitoramento em tempo real e a seleção de eletrodos de estimulação é realizado por uma interface gráfica personalizada do usuário (GUI).
Introduction
Epilepsia é uma desordem progressiva fatal, causando a atividade descontrolada do cérebro1; Ele carrega entre o maior fardo da doença e o estigma social significativo2,3. TLE é a síndrome mais frequente (40%) e a mais frequentemente (~ 30%) resistentes à medicação anti-epiléptica4. Enquanto a ablação cirúrgica do tecido epileptogênica pode melhorar as condições do paciente, não é viável em todos os pacientes e não pode garantir uma vida completamente livre de apreensão de5. Modulação de epilépticas límbicas redes por DBS elétrica é uma abordagem promissora quando o tratamento farmacológico ou neurocirurgia não são adequados.
Fatias de cérebro de roedor são uma ferramenta valiosa para estudar a função de redes neuronais como na saúde e na doença6 por meio de técnicas de eletrofisiologia em vitro , como eles preservar, pelo menos em parte, a arquitetura original e conectividade do cérebro região (ões) de interesse (ROI). Em particular, fatias de córtex (hipocampo-CE) horizontal combinado hipocampo-entorhinal compõem as redes neuronais essenciais envolvido no TLE e consequentemente são rotineiramente empregadas em vitro TLE pesquisa7.
Apreensão-como a atividade pode ser aguda induzida em fatias do cérebro, alterando a composição iônica do fluido cerebrospinal artificial (ACSF), tais como a diminuição de magnésio enquanto aumenta o potássio8,9,10, ou por meio de manipulações farmacológicas, tais como bloqueio atividade inibitória gabaérgica (ver11 para uma revisão abrangente). No entanto, estes modelos são baseados na alteração desequilibrada de excitação e inibição; assim, eles não permitem estudar a interação e contribuição concertada das redes excitatórias e inibitórias para ictogenesis. Perfusão contínua de fatias do cérebro com o 4AP convulsivante droga aumenta a neurotransmissão excitatório e inibitório, permitindo assim a estudar ictogenesis aguda, mantendo a atividade sináptica no geral intacta12.
Como permite a gravação da atividade elétrica gerada pelas redes neuronais de um maior número de pontos de observação em relação ao potencial gravação de campo extracelular convencional, onde restrições espaciais limitam o número de eletrodos que podem ser acomodados na superfície de fatia do cérebro. Além disso, os chips MEA oferecem a vantagem da distância eletroda inter conhecida, que é muito útil para a propagação de rastreamento e avaliar a velocidade de viagem dos sinais gravados. Apesar de inicialmente concebido para a gravação de neurônios cultivados13,14, MEAs agora são também usados para caracterizar as características eletrofisiológicas de fatias de cérebro aguda, obtidas de roedores15 e humanos16. Assim, no contexto da investigação de epilepsia, MEAs representam uma ferramenta valiosa para identificar as interações das redes neuronais no núcleo de ictogenesis16,17,18.
No entanto, a gravação de MEA inerentemente carrega desafios técnicos na obtenção ou manutenção de um padrão de epileptiforme estável ao longo de protocolos experimentais de long (várias horas). Primeiro, oxigenação dos tecidos pode não ser adequada dentro da grande e redondo tipo submersa gravação câmara19,20 típico de MEAs comercialmente disponíveis, enquanto o pobre relação sinal-ruído e instabilidade de temperatura podem afetar a qualidade da gravação quando uma taxa alta de perfusão (6-10 mL/min) é usada para melhorar o fornecimento de oxigênio para a fatia do cérebro (veja por exemplo as notas técnicas em equipamentos de aquecimento e perfusão21). Segunda, recorrentes descargas com componentes de alta frequência, como as descargas epileptiforme, dificilmente são observadas quando usando câmaras de gravação tipo submersa19; Este é particularmente o caso quando o padrão epileptiforme aguda é quimicamente induzido e envolve mecanismos de ephaptic, como é o caso para a 4AP modelo22 (ver11 para uma visão abrangente). Para superar essas limitações, várias estratégias têm sido propostas por pesquisadores. Por exemplo, aumentando a taxa de perfusão19,20 , reduzindo a espessura da fatia de cérebro (≤300 µM) e área de17,18 é fatores cruciais para a realização adequada de oxigênio aos tecidos. Além disso, cérebro maior fatia viabilidade também pode ser realizada usando MEAs perfurados (pMEAs), que permitem perfusing o tecido cerebral de ambos os lados,18.
Considerando que as abordagens descritas melhoraram significativamente a viabilidade de gravação MEA de fatias do cérebro, eles não foram testados contra prolongada (várias horas) sessões de estimulação elétrica e gravação, o último que representa um significativo estresse para o tecido cerebral. Sessões de gravação prolongada podem ser necessária para estudar a evolução no tempo das características específicas do epileptiforme padrões que não seria possíveis desmascarar por medidas a curto prazo. No contexto da investigação DBS, protocolos experimentais prolongados podem ser necessária para avaliar e comparar os efeitos dos vários paradigmas de estimulação na mesma fatia do cérebro.
Quando apenas a atividade elétrica espontânea precisa ser gravado, mapeamento dos eletrodos no que diz respeito o ROI geralmente é feito a posteriori, ou seja, durante a análise de dados; em vez disso, o estudo das respostas evocadas ou dos paradigmas de neuromodulação elétrica requer que a estimulação seja entregue à ROI(s) específica, ditando a necessidade de mapeamento de rápida e fácil ao eletrodo durante o experimento.
Aqui, podemos ilustrar um protocolo experimental simples que permite a indução e manutenção de um padrão estável induzida por 4AP epileptiforme em fatias de cérebro de roedor adulto. A atividade observada reproduz fielmente as características eletrofisiológicas deste modelo como caracterizadas usando técnicas convencionais de eletrofisiologia extracelular. Ele persiste por várias horas e sobrevive à estimulação elétrica sustentada por épocas de prolongada repetidas. As câmaras utilizadas para manter e incubar as fatias do cérebro podem ser facilmente montadas usando suprimentos laboratoriais padrão (figura 1A), Considerando que uma câmara de gravação personalizada, permitindo a solução ideal de taxa de câmbio e fluxo laminar (figura 1B) pode ser obtidos de fontes comerciais ou usando a tecnologia de impressão 3D a um preço acessível. Mapeamento rápido do ROI(s) para monitoramento em tempo real e para a seleção de eletrodos de estimulação é tornado possível por uma GUI amigável personalizado chamado mapMEA, livremente disponíveis mediante solicitação.
Figura 1: equipamento personalizado usado para esse protocolo. (A) exploração câmaras para recuperação, pré-aquecimento e pré-incubação em 4AP são montadas com um copo e um prato de Petri. O prato de Petri deve ser menor em diâmetro que o disjuntor e é mantido no lugar por meio de um êmbolo da seringa. Parte inferior da caixa de Petri é substituída por uma malha de nylon (a partir de meias de suaves), colada com cianoacrilato na borda da caixa de Petri. Oxigênio é fornecido através de uma agulha espinhal torta (22 G), inserida entre as paredes da caixa de Petri e o copo. Bolhas devem ser emergentes do lado do copo e nunca chegar a tela de nylon para evitar deslocamento de fatia do cérebro. Parte superior de um prato de Petri pode ser usado como uma tampa para evitar evaporação ACSF e manter a saturação de oxigênio. (B) câmara de gravação personalizada. em: reservatório de entrada para acomodar a cânula de aquecimento e o eletrodo de referência. para fora: reservatório de tomada para acomodar a agulha de aspiração. Câmara de rec: gravação. (C) vidro pipetas, enrolada por fogo-polimento, usado para tratar o tecido e ajustar sua posição dentro da câmara de gravação. Âncora de grampo de fatia (D) personalizado. (E) a montagem Final da câmara de gravação montado sobre o chip MEA. Uma fatia do cérebro baseia-se na parte inferior mantida no lugar pela âncora. A seta vermelha indica o tubo de PTFE, cobrindo a cânula de aquecimento, o círculo vermelho indica o eletrodo de referência, uma pelota de KCl saturado submergida por ACSF no reservatório de entrada. A seta azul indica a agulha de aspiração no reservatório da tomada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
MEAs são uma ferramenta valiosa para investigações de neurofisiologia e tem atingido a maturidade nos últimos anos graças a décadas de exploração e desenvolvimento. Em comparação com a gravação de potenciais de campo convencional, MEAs oferecem a grande vantagem de um maior número de pontos de observação e distância eletroda inter conhecida, que são cruciais para identificar com precisão as interações de rede neuronal.
A técnica de gravação MEA também pode ser acoplada a outras abordagens de eletrofisiologia, tais como gravação remendo-braçadeira15, para investigar a relação entre um único neurônio e atividade da rede neuronal. Além disso, a possibilidade de visualizar o campo potenciais e multi-unidade atividade simultaneamente pode fornecer insights preciosos sobre a correlação entre a atividade de pequenos conjuntos neuronais e redes neuronais coletivas. A combinação com corantes sensíveis à voltagem, imagem de cálcio e optogenetics29 permite inferir fenômenos de Neurofisiologia utilizando abordagens poliédrico. Além de estudos farmacológicos, a possibilidade de realizar tanto a gravação e a estimulação com o mesmo sistema faz a técnica de gravação MEA muito poderoso e versátil: por exemplo, é possível estudar os fenômenos de plasticidade sináptica na núcleo de memória formação30, usando os protocolos de neuromodulação apresentados aqui, que são relevantes para DBS para tratar a epilepsia e uma grande variedade de distúrbios cerebrais. A recente prova que a técnica de gravação MEA pode ser aplicada com sucesso ao cérebro humano epiléptica tecido16 demonstra sua utilidade inestimável na investigação de epilepsia, tanto para compreender os mecanismos básicos subjacentes a esta doença devastadora e para aperfeiçoar algoritmos DBS para amenizar isso.
No entanto, MEAs forçar a busca de experiências de eletrofisiologia em condições de ‘limite’ para fatias do cérebro, devido a exigência de uma câmara de gravação submerso e a necessidade de deixar o cérebro fatia restante sobre o substrato sólido onde os microeletrodos são integrados. Assim, o tecido cerebral não pode receber adequada de oxigênio, que por sua vez pode afetar a qualidade das gravações.
O protocolo descrito aqui permite gravar de forma confiável e estudar ictogenesis em roedores redes sistema límbicas acopladas ao MEAs usando o modelo de aguda 4AP in vitro e prosseguir épocas de prolongada estimulação elétrica, que fornecem informações relevantes para a avaliação das políticas DBS.
Estudos anteriores na neuromodulação elétrica de epilépticas límbicas redes baseados no uso de potenciais gravação convencional de campo usei fatias de cérebro de rato ou rato com semelhante resultados2524,; Mas o uso de tecido de cérebro de rato provou ser mais desafiador, razoavelmente devido a conectividade mais fraca em comparação com o tecido cerebral obtido a partir de ratos7. No que se refere a técnica MEA, fatias de cérebro de rato são mais adequadas em virtude de sua menor dimensão. Além disso, dada a maior taxa de ocorrência de descargas estável, como em rato contra tecido de cérebro de rato, é possível testar significativamente mais fatias de cérebro durante todo um dia experimental, que por sua vez faz a coleta de dados mais rápida e eficiente, e pode Reduza o número de animais utilizados.
Importância no que diz respeito a métodos existentes:
Descargas estável gravadas usando a câmara personalizada descrita aqui parecem ser semelhantes, em duração e taxa de ocorrência àqueles observados usando a câmara de anel MEA convencional e o mesmo tipo MEA (microeletrodos planares, cf. 17). No entanto, ele precisa ser enfatizado que espessura da fatia cerebral deve ser significativamente reduzida quando utilizando a câmara de gravação redonda convencional juntamente com uma taxa baixa perfusão (1 mL/min), que pode dificultar a busca bem sucedida da neuromodulação experimentos devido a conectividade pobre.
Neste protocolo, uma câmara de gravação personalizada de baixo volume inspirada pela concepção da remendo-braçadeira gravação câmara fornece fluxo laminar estável e confiável que é crucial para a bem sucedida busca de gravações de MEA; Ele também permite aumentar a espessura da fatia de cérebro de 400 µm para atingir uma troca justa entre viabilidade de tecido e conectividade intrínseca. É fato reconhecido que o fluxo laminar da solução de gravação dentro da câmara é altamente desejável para eletrofisiologia de fatia do cérebro, desde que não é afetado pela temperatura, oxigênio, e gradientes de pH que são observadas no fluxo circular redonda gravação câmaras19,20,31 (como os fornecidos com MEA comercialmente disponível). Tais gradientes introduzir viés experimental e também são prejudiciais para a fatia do cérebro. Câmaras de gravação de um volume relativamente pequeno (~1.5 mL) junto com uma perfusão elevada taxa (5-6 mL/min)16,31 permitam intercâmbio adequado do meio de perfusão (≥3 vezes / min). A câmara personalizada pode ser facilmente obtidos de fontes comerciais, a um preço acessível ou produzidos internamente, utilizando tecnologia de impressão 3D. Outros estudos relataram gravações MEA de 400 µm de espessura de cérebro humano fatias16 utilizando a câmara de anel MEA convencional, mantendo o volume ACSF para 1 mL e impor uma taxa de perfusão elevada (5-6 mL/min) com a ajuda de uma bomba peristáltica de baixo ruído. No entanto, os autores utilizaram um modelo diferente de ictogenesis, ou seja, o baixo Mg2 +, que é provável que o modelo 4AP menos influenciada ephaptic mecanismos envolvendo um aumento significativo na concentração extracelular de K+ 11 , 22. encontramos que uma taxa elevada de perfusão não é desejável no modelo 4AP, possivelmente devido a lavagem rápida fora de acumulada extracelular K+, que talvez precise ser aumentado significativamente na gravação ACSF16. Na verdade, eventos estável apareceram mais em ‘partes’ quando a velocidade de perfusão ASCF foi aumentada para 2-3 mL/min e a fatia do cérebro foi submerso por uma espessa camada ACSF, Considerando que as descargas full-blown exibindo robustos componentes tônico-clônica poderiam ser restauradas após o retorno ao uma taxa mais baixa perfusão (1 mL/min) e um mais fino ACSF camada direita no nível da superfície de tecido (dados não mostrados). A câmara de gravação personalizada descrita neste protocolo permite trocar o meio de perfusão de 3 – 5 vezes / min em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Assim, o suprimento de oxigênio global para as fatias de cérebro é fortemente melhorado mesmo em taxas relativamente baixa perfusão, garantindo ainda um estábulo gravação de temperatura e alta relação sinal-ruído. Mais importante ainda, é possível manter a concentração extracelular de K+ para um valor fisiológico.
O modelo de 4AP de ictogenesis não requer qualquer modificação significativa da composição iônica ACSF, tais como redução Mg2 + ou crescente K+e oferece a vantagem exclusiva de manter intacta a transmissões excitatórias e inibitórias 12, um aspecto que é altamente relevante na investigação de epilepsia, tendo em conta o papel crucial de glutamatérgico e gabaérgica redes em sincronização epileptiforme (cf. 7). O 4AP-ACSF usado neste protocolo contém uma concentração fisiológica de K+ (3,25 mM) e Mg2 + concentração ligeiramente menor do que a exploração ACSF (1 mM contra 1,3 mM). Esta concentração ainda cai dentro dos valores fisiológicos relatados de Mg2 + concentração no roedor CSF e é usado em muitos laboratórios (ver, por exemplo,17,,18). Para o propósito do protocolo descrito, achamos que este ligeiro decréscimo é preferido para auxiliar no efeito do 4AP.
Em trabalho anterior, 4AP aplicou-se para a fatia do cérebro quando ele já estava posicionado dentro da câmara de gravação17,18. A menos que o experimentador precisa observar a latência de tempo entre a aplicação de 4AP e o aparecimento de padrões epileptiforme, descobrimos que essa abordagem é bastante demorada e não é adequada para prosseguir a gravação prolongada e sessões de estimulação descrito neste protocolo. Pré-incubação de fatias de cérebro em 4AP a 32 ° C permite poupar tempo muito experimental, desde as fatias do cérebro podem ser previamente tratadas em série enquanto prossegue o experimento usando outras secções de tecido.
A prolongada viabilidade de fatias do cérebro pode ser útil para analisar as características da rede a longo prazo. Além disso, sua resiliência melhorada para estimulação elétrica repetitiva é de grande vantagem se o experimentador quer comparar vários protocolos de estimulação, que devem ser realizados na mesma fatia do cérebro para robustez estatística. Em nossas mãos, quando o teste 3 protocolos de estimulação, cada uma precedida por uma fase de controlo e seguido por uma fase de recuperação, a experiência pode durar 3-5 h. Neste contexto, ao mapeamento de MEA é crucial para ativar o caminho correto e suprimir, ao invés de favorecer a ictogenesis através de estimulação elétrica. Nossa GUI amigável representa uma ferramenta rápida, simples e flexível para mapear os eléctrodos de estruturas cerebrais diferentes. Ao contrário do software comercial, é possível adicionar layouts personalizados de MEA mesmo com habilidades básicas de programação. Imagens podem ser adquiridas em campo claro; assim, qualquer câmera de propósito geral que tem boa resolução e se encaixa em um microscópio é apropriada. Um microscópio invertido é essencial para visualizar a posição de microeletrodos em relação a fatia do cérebro, uma vez que estas ia ser escondidas por baixo do tecido se usando um microscópio vertical. No entanto, um estereoscópio recomenda-se, além do tipo invertido, se o experimentador precisa executar cortes de faca para interromper as vias neuronais específicas.
Finalmente, uma vantagem adicional da abordagem proposta é a montagem barata e relativamente fácil da maioria das ferramentas necessárias, como a câmara de gravação personalizada e câmaras de exploração, o banho quente e a fatia de âncora, bem como o uso desnecessário de um caro bomba peristáltica de baixo ruído.
Limitações da técnica:
Gravação de MEA não permite visualizar ondas muito lentas, ou seja, DC desloca-se no sinal. Tais desvios da linha de base podem ajudar assintótica medição da duração de descarga estável e, mais importante, eles são fundamentais para estudar a depressão espalhando cortical (um fenômeno que se relaciona com a morte inesperada súbita em epilepsia32 e é compartilhado entre enxaqueca e epilepsia33).
No que se refere a neuromodulação elétrica, o protocolo descrito aqui permite realizar várias sessões de estimulação sem afetar a viabilidade de fatia do cérebro. Poderíamos fazer com êxito até 3 sessões de estimulação de 20-45 min, semelhante ao que relatou no anterior trabalho25. Apesar de fatias de cérebro provavelmente podem suportar um número maior de sessões de estimulação ou mais protocolos de estimulação, não testámos fatias de cérebro a este respeito. É recomendável limitar o número de protocolos de estimulação para 3 e evitando prolongadas sessões de estimulação (≥60 min), que podem significativamente estresse mantido sob estas condições de limite, até a falta de recuperação após a retirada do estímulo de tecido cerebral.
Passos críticos dentro do protocolo:
Vários fatores críticos podem impedir a busca bem sucedida da gravação e modulação da atividade epileptiforme em fatias de cérebro acoplado a MEA. Além das espécies de roedores utilizadas e a qualidade das fatias do cérebro, a taxa de perfusão durante a gravação e a dinâmica do fluxo ACSF (i. e., laminar contra circular) dentro da câmara de gravação, encontramos que as condições de recuperação e manutenção a longo prazo das fatias do cérebro, bem como o modo de aplicativo do 4AP são os passos mais críticos.
Ao usar uma câmara de exploração submerso é crucial armazenar as fatias do cérebro à temperatura ambiente para preservar a atividade de rede de tecido cerebral e favorecer a indução de estável, como descargas pelo aplicativo 4AP. Em nossas mãos, recuperação e manutenção a 32 ° C deteriorou-se o tecido de cérebro dentro de 3-4 h de fatiar.
Fatias de incubação do cérebro em 4AP-ACSF à temperatura ambiente e gravação a 32 ° C é, no entanto, não é desejável. Encontramos muitas dificuldades em observar robustas recorrentes descargas estável nesta condição. Com efeito, baixas temperaturas na faixa de 20 a 24 ° C têm sido relatadas para umedecer ou até mesmo evitar ictogenesis induzida por 4AP ambos em vitro34 e na vivo35. Assim, as temperaturas de incubação e gravação de 4AP devem ser abrangidos o 30-34 ° C e devem ser correspondidas. Para evitar colocar o tecido cerebral sob muito stress devido a indução simultânea de hiperexcitabilidade por 4AP e a exposição súbita de fatias de cérebro da temperatura para a morna (32 ° C) 4AP-ACSF, é fundamental realizar um pré-aquecimento intermediário passo e deixe que as fatias de cérebro se habituar à exploração ACSF a 32 ° C, durante 20-30 min. pular esta etapa podem afetar a indução de ictogenesis por 4AP.
Outro aspecto que deve ser mencionado é a importância da concentração de D-glicose na ACSF após fatiar. Uma concentração de 25 mM preserva as fatias do cérebro melhores do que a concentração de 10 mM, utilizada em muitos laboratórios e também melhora a taxa de ocorrência de atividade estável, que é 2 vezes mais rápida (assim, tornando mais fácil para perseguir uma longa série de experimental protocolos em várias fatias de cérebro cada dia).
Por último, alguns detalhes importantes durante o procedimento de corte precisam ser mencionado. Em primeiro lugar, não permitir que o cérebro intacto e as fatias de cérebro para congelar no frio corte ACSF. Refrigeração do cérebro para < 2 min é suficiente, dado o pequeno tamanho do cérebro do rato. Cortes de tecido devem ser transferidos imediatamente da bandeja do amortecedor para o béquer lavagem à temperatura ambiente. ACSF enxaguar o corte é muito importante, que caso contrário a concentração de sacarose alta fará com que o cérebro fatias grudar a malha de nylon da câmara de exploração. Para efetivamente enxaguar o tecido, é importante minimizar o conteúdo ACSF corte dentro da pipeta de transferência a fim de não contaminar a exploração ACSF excessivamente. A lavagem de 2 estágios ajuda a minimizar a contaminação. Após a conclusão do procedimento de corte, cortes de tecido devem ser transferidos imediatamente partir os copos de lavagem para a câmara de exploração, onde a macia de nylon malha suspensa a meio caminho na exploração ACSF permite a oxigenação dos tecidos em ambos os lados. O mesmo princípio deve ser aplicado em todas as fases seguindo o procedimento de corte: fatias de cérebro nunca devem sentar-se no fundo do copo, não devem estar em contacto com os lados das câmaras de exploração, e eles nunca devem estar em contacto entre si, nem se sobrepõem.
Modificações e solução de problemas:
Composição de ACSF pode ser modificada de acordo com necessidades do experimentador. Por exemplo, drogas podem ser adicionadas para dissecar a contribuição de neurotransmissores específicos ou canais iônicos para a eficácia de neuromodulação elétrica. Além disso, pirúvico e ácido ascórbico (cf. quadro 2) podem ser omitidos, apesar de acharmos que eles exercem um papel neuroprotetor poderoso. Nós relatamos na tabela 3 os problemas mais comuns que podem ser encontrados no presente protocolo e como lidar com eles.
Conclusões:
Gravação de MEA, sem dúvida, é uma técnica de inestimável para abordar as interações das redes neuronais na saúde e na doença. Além de estudos farmacológicos, também é possível avaliar protocolos de neuromodulação elétrica que são relevantes para DBS aplicado a epilepsia e outras doenças neurológicas. Neste protocolo, mostramos que é possível reproduzir os experimentos de estimulação periódica típica com resultados semelhantes aos obtidos com potencial gravação convencional campo extracelular e externo de eletrodos de estimulação. A crescente disponibilidade de equipamentos comerciais de user-friendly e ferramentas de software avançadas fazem a técnica de gravação MEA também apropriado para experimentos de estimulação de loop fechado, para fornecer a estimulação ad hoc para o tecido cerebral e investiga a contribuição dos mecanismos de feedback às respostas da rede neuronal.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.P. é Marie Skłodowska-Curie Fellow financiado pelo projecto da União Europeia ACEM-IF-2014 Re.B.Us, G.A. n.660689, no âmbito do programa quadro H2020. MapMEA o GUI é livremente disponível mediante solicitação ao autor ilaria.colombi@iit.it.
Materials
| Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
| NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
| KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
| KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
| CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
| D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
| NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
| MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
| MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
| Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
| 4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
| STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
| MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
| planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
| McRack | Multichannel System | Recording software | |
| McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
| TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
| PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
| MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
| Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
| MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
| Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
| MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
| VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
| Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |
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