Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi
Summary
Vi illustriamo come eseguire registrazione ed elettrica modulazione di attività epileptiform indotta da 4-aminopyridine in fettine di cervello del roditore utilizzando matrici microelettrodo. Una camera di registrazione personalizzata mantiene la vitalità del tessuto durante prolungate sessioni sperimentali. Live mapping di elettrodo e selezione di coppie stimolante sono eseguite da un’interfaccia di utente grafica personalizzata.
Abstract
Epilessia del lobo temporale (TLE) è la più comune sindrome epilettica complessa parziale e il meno sensibile ai farmaci. Stimolazione cerebrale profonda (DBS) è un approccio promettente quando il trattamento farmacologico non riesce o neurochirurgia non è raccomandato. Fettine di cervello acuto accoppiate a matrici di microelettrodi (MEA) rappresentano uno strumento prezioso per studiare le interazioni di rete neuronale e loro modulazione da stimolazione elettrica. Rispetto alle tecniche convenzionali registrazione extracellulare, che forniscono il vantaggio aggiunto di un maggior numero di punti di osservazione e una distanza nota Inter-elettrodo, che permettono di studiare il percorso di propagazione e velocità di elettrofisiologici segnali. Tuttavia, l’ossigenazione dei tessuti può essere notevolmente alterata durante MEA registrazione, che richiede un tasso alto di aspersione, che arriva al costo di rapporto segnale-rumore in diminuzione e superiore oscillazioni della temperatura sperimentale. Stimolazione elettrica ulteriormente sottolinea il tessuto cerebrale, che lo rende difficile da perseguire epoche di registrazione/stimolazione prolungata. Inoltre, elettrica modulazione dell’attività cerebrale fetta deve fare riferimento a specifiche strutture/vie all’interno della slice di cervello, che richiedono che il mapping di elettrodo facilmente e rapidamente eseguite dal vivo durante l’esperimento. Qui, vi illustriamo come eseguire la registrazione ed elettrica modulazione di 4-aminopiridina (4AP)-ha indotto l’attività epileptiform in fettine di cervello del roditore utilizzando MEAs planare. Indichiamo che il tessuto cerebrale ottenuti da topi supera il tessuto di cervello di ratto e così è più adatto per esperimenti MEA. Questo protocollo garantisce la generazione e la manutenzione di un modello stabile epileptiform che fedelmente riproduce le caratteristiche elettrofisiologiche osservate con registrazione potenziale campo convenzionale, persiste per diverse ore e dura più a lungo sostenuta stimolazione elettrica per epoche prolungate. Redditività dei tessuti in tutto l’esperimento è raggiunta grazie all’utilizzo di una camera di registrazione personalizzato piccolo-volume consentendo per flusso laminare e lo scambio di soluzione rapida anche a bassa (1 mL/min) velocità di perfusione. Veloce MEA mapping per monitoraggio in tempo reale e selezione degli elettrodi di stimolazione viene eseguito da un’interfaccia di utente grafica personalizzata (GUI).
Introduction
L’epilessia è un disordine progressivo pericolosa causando attività incontrollata del cervello1; trasporta tra il più alto carico di malattia e stigma sociale significativo2,3. TLE è la sindrome più frequente (40%) e il più frequentemente (~ 30%) resistente ai farmaci anti-epilettici4. Mentre l’ablazione chirurgica del tessuto epilettogeno può migliorare la condizione del paziente, non è fattibile in tutti i pazienti e non può garantire una vita completamente grippaggio-libero5. Modulazione delle reti epilettici limbiche di DBS elettrico è un approccio promettente quando trattamento farmacologico o neurochirurgia non sono adatti.
Fette del cervello del roditore sono uno strumento prezioso per studiare la funzione di reti come un neurone nella salute e nella malattia6 per mezzo di tecniche di elettrofisiologia in vitro , come conservare, almeno in parte, l’architettura originale e la connettività del cervello regioni di interesse (ROI). In particolare, orizzontale combinato ippocampo-entorhinal corteccia (ippocampo-CE) fette comprendono le essenziali reti neuronali coinvolte in TLE e pertanto sono abitualmente impiegati in vitro TLE ricerca7.
Attività di grippaggio-come può essere indotta acutamente nelle fette del cervello modificando la composizione ionica del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), come la diminuzione di magnesio mentre aumenta il potassio8,9,10, o per mezzo di manipolazioni farmacologiche, come il blocco di attività inibitoria GABAergica (Vedi11 per una rassegna completa). Tuttavia, questi modelli sono basati sull’alterazione sbilanciato di eccitazione ed inibizione; Pertanto, non consentono lo studio della interazione e concertata contributo delle reti eccitatorie ed inibitorie a ictogenesi. Migliora la perfusione continua di fette del cervello con il farmaco convulsivante 4AP neurotrasmissione sia eccitatori che inibitori, permettendo così di studiare ictogenesi acuta pur mantenendo intatta la attività sinaptica nel complesso12.
MEAs consentono di registrare l’attività elettrica generata da reti neuronali da un maggior numero di punti di osservazione rispetto al potenziale registrazione campo extracellulare convenzionale, dove restrizioni spaziali limitano il numero di elettrodi che possono essere accomodato sulla superficie della fetta del cervello. Inoltre, MEA chip offrono il vantaggio aggiunto di distanza inter-elettrodo nota, che è molto utile alla propagazione di traccia e valutare la velocità di viaggio di segnali registrati. Anche se inizialmente concepito per la registrazione da neuroni coltivati13,14, MEAs ora sono anche usate per caratterizzare le caratteristiche elettrofisiologiche di fettine di cervello acuto ottenuti da roditori15 e gli esseri umani16. Così, nel contesto della ricerca di epilessia, MEAs rappresentano uno strumento prezioso per individuare interazioni delle reti neuronali alla base del ictogenesi16,17,18.
Tuttavia, registrazione MEA trasporta inerentemente sfide tecniche nell’ottenere o mantenere un modello stabile epileptiform in tutta protocolli sperimentali lunga (diverse ore). In primo luogo, l’ossigenazione dei tessuti può non essere adeguato all’interno del grande e sommerso di registrazione camera19,20 tipici di MEAs commercialmente disponibili, mentre povero rapporto segnale-rumore e instabilità della temperatura potrebbe influenzare la qualità della registrazione quando un tasso elevato di aspersione (6-10 mL/min) è utilizzato per migliorare l’apporto di ossigeno per la fetta di cervello (Vedi ad esempio le note tecniche su riscaldamento e perfusione attrezzature21). In secondo luogo, il ricorrenti gli scarichi con componenti ad alta frequenza, quali scarichi epileptiform, difficilmente sono osservati quando si utilizza tipo sommerso registrazione Colombo19; Questo è specialmente il caso quando il pattern epileptiform acuta è chimicamente indotta e coinvolge meccanismi ephaptic, come è il caso per il modello 4AP22 (Vedi11 per una panoramica completa). Per superare queste limitazioni, sono state proposte diverse strategie dai ricercatori. Ad esempio, aumentando il tasso di aspersione19,20 , riducendo lo spessore fetta di cervello (≤ 300 µM) e zona17,18 è fattori cruciali per il raggiungimento di un’adeguata di ossigeno al tessuto. Inoltre, migliore cervello fetta attuabilità è possibile anche utilizzando perforato MEAs (pMEAs), che permettono che irrora il tessuto cerebrale da entrambi i lati di18.
Considerando che gli approcci descritti hanno notevolmente migliorato la fattibilità di registrazione MEA da fettine di cervello, essi non sono stati testati contro prolungato (diverse ore) sedute di stimolazione elettrica e registrazione, quest’ultima rappresentando un significativo stress per il tessuto cerebrale. Sessioni di registrazione prolungato potrebbero essere necessario studiare l’evoluzione nel tempo delle caratteristiche specifiche di modelli epileptiform che non sarebbe possibile smascherare tramite le misure a breve termine. Nel contesto della ricerca DBS, protocolli sperimentali prolungati potrebbero essere necessario valutare e confrontare gli effetti di diversi paradigmi di stimolazione nella stessa fetta di cervello.
Quando solo un’attività elettrica spontanea deve essere registrata, mappatura degli elettrodi per quanto riguarda il ROI è di solito fatto a posteriori, cioè, durante l’analisi dei dati; invece, lo studio delle risposte evocate o dei paradigmi di neuromodulazione elettrica richiede che stimolazione consegnato a specifici ROI(s), dettando la necessità del mapping di facile e veloce dal vivo elettrodo durante l’esperimento.
Qui, vi illustriamo un semplice protocollo sperimentale che permette per induzione e il mantenimento di un modello stabile epileptiform 4AP-indotta nelle fette del cervello del roditore adulto. L’attività osservata riproduce fedelmente le caratteristiche elettrofisiologiche di questo modello come caratterizzato utilizzando tecniche di elettrofisiologia extracellulari convenzionali. E persiste per diverse ore e dura più a lungo sostenuta la stimolazione elettrica per ripetute epoche prolungate. Gli alloggiamenti utilizzati per mantenere e incubare le fette di cervello possono essere montati facilmente utilizzando standard di laboratorio forniture (Figura 1A), considerando che una camera di registrazione personalizzato consentendo una soluzione ottimale tasso di cambio e a flusso laminare (Figura 1B) può essere ottenuti da fonti commerciali o utilizzando la tecnologia di stampa 3D ad un prezzo abbordabile. Mappatura rapida di ROI(s) per il monitoraggio in tempo reale e per la selezione degli elettrodi di stimolazione è reso possibile da un’interfaccia molto intuitiva personalizzata denominata mapMEA, liberamente disponibili su richiesta.
Figura 1: attrezzatura personalizzata utilizzata per questo protocollo. (A) la detenzione alloggiamenti per recupero, pre-riscaldamento e pre-incubazione in 4AP sono assemblati con un bicchiere e una capsula di Petri. Di Petri deve essere di diametro inferiore l’interruttore e viene tenuto in posizione per mezzo di un pistone della siringa. Fondo di Petri è sostituito da una rete di nylon (da morbide calze) incollata con cianoacrilato sul cerchio del piatto Petri. Ossigeno è fornito tramite un ago spinale piegato (22 G), inserito tra le pareti di Petri e il becher. Bolle dovrebbero essere emergenti dal lato del bicchiere e mai raggiungere la rete di nylon per evitare lo spostamento di fetta di cervello. Parte superiore di una capsula di Petri può essere usato come coperchio per evitare l’evaporazione ACSF e mantenere la saturazione di ossigeno. Camera di registrazione personalizzata di (B). in: serbatoio di aspirazione per ospitare la cannula di riscaldamento e l’elettrodo di riferimento. fuori: serbatoio di presa per ospitare l’ago di aspirazione. Camera di REC: registrazione. Pipetta Pasteur di vetro (C), arricciata di fuoco-lucidatura, utilizzato per gestire il tessuto e regolarne la posizione all’interno della camera di registrazione. Ancoraggio di Hold-Down fetta Custom (D). Il montaggio finale (E) della camera di registrazione montato sul chip MEA. Una fetta di cervello poggia sul fondo tenuto dal punto di ancoraggio. La freccia rossa indica la tubazione di PTFE che copre la cannula di riscaldamento, mentre il cerchio rosso indica l’elettrodo di riferimento, un pellet di KCl saturo sommersa da ACSF nel serbatoio di aspirazione. La freccia blu indica l’ago di aspirazione del serbatoio di scarico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
MEAs sono uno strumento prezioso per le indagini di neurofisiologia e hanno raggiunto la maturità negli ultimi anni grazie a decenni di esplorazione e sviluppo. Rispetto alla registrazione di potenziali di campo convenzionale, MEAs offrono il grande vantaggio di un maggior numero di punti di osservazione e la distanza inter-elettrodo nota, che sono cruciali per individuare con precisione interazioni di rete neuronale.
La tecnica di registrazione MEA può essere accoppiata anche ad altri approcci di elettrofisiologia, quali registrazione toppa-morsetto15, per indagare il rapporto tra singolo neurone e attività di rete di un neurone. Inoltre, la possibilità di visualizzare contemporaneamente potenziali di campo e attività multi-unità può fornire preziose intuizioni la correlazione tra l’attività di un neurone piccoli ensemble e collettive reti neuronali. La combinazione con coloranti di tensione-sensibili, calcio imaging e optogenetica29 permette la deduzione di fenomeni di neurofisiologia utilizzando approcci poliedrici. Oltre a studi farmacologici, la possibilità di eseguire la registrazione e la stimolazione con lo stesso sistema rende la tecnica di registrazione MEA molto potente e versatile: ad esempio, è possibile studiare i fenomeni di plasticità sinaptica presso il nucleo di memoria formazione30, utilizzando i protocolli di neuromodulazione qui presentati, che sono rilevanti per DBS per trattare l’epilessia e un’ampia varietà di disordini del cervello. La prova recente che la tecnica di registrazione di MEA possa essere applicata correttamente al cervello epilettico umano tessuto16 dimostra suo inestimabile utilità nella ricerca di epilessia, sia per capire i meccanismi di base alla base di questa malattia devastante e per ottimizzare gli algoritmi DBS per migliorare esso.
Tuttavia, MEAs forzare la ricerca di esperimenti di elettrofisiologia in condizioni di «limite» per fette del cervello, dovuto il requisito di una camera di registrazione sommerso e la necessità di lasciare il cervello fetta resto su substrato solido dove i micro-elettrodi sono integrati. Così, tessuto cerebrale non riceva adeguata di ossigeno, che a sua volta può influenzare la qualità delle registrazioni.
Il protocollo descritto qui permette di registrare in modo affidabile e studiare ictogenesi in roditore reti limbiche accoppiate a MEAs utilizzando il modello di acuta 4AP in vitro e di perseguire prolungate epoche di stimolazione elettrica, che forniscono informazioni rilevanti per la valutazione delle politiche DBS.
Gli studi precedenti sulla neuromodulazione elettrica delle reti limbiche epilettici basato sull’uso di registrazione potenziale campo convenzionale hanno usato fettine di cervello di topo o ratto con simili risultati24,25; ma l’uso del tessuto di cervello di ratto si è rivelato più impegnativo, ragionevolmente a causa della connettività più debole rispetto al tessuto cerebrale ottenuti da topi7. Per quanto riguarda la tecnica MEA, fettine di cervello di topo sono più adatti in virtù della loro dimensione più piccola. Inoltre, dato il più alto tasso di occorrenza degli scarichi ictal-come nel topo contro il tessuto del cervello del ratto, è possibile testare significativamente più fette del cervello in tutto un giorno sperimentale, che a sua volta rende la raccolta di dati più veloce ed efficiente, e può ridurre il numero di animali utilizzati.
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti:
Gli scarichi ictal registrati usando la camera personalizzata descritta qui sembrano essere simili in durata e tasso di incidenza a quelli osservati con la camera di cottura convenzionale di MEA e dello stesso tipo MEA (micro-elettrodi planari, cf. 17). Tuttavia, deve essere dato risalto a che spessore della fetta di cervello deve essere ridotta significativamente quando la registrazione circolare convenzionale nella camera insieme con una tariffa bassa perfusione (1 mL/min), che può ostacolare il riuscito inseguimento di neuromodulazione esperimenti causa di scarsa connettività.
In questo protocollo, una camera di registrazione personalizzato basso volume ispirata patch clamp registrazione camera design fornisce stabile e affidabile flusso laminare che è cruciale per il riuscito inseguimento di registrazioni MEA; permette inoltre di aumentare lo spessore della fetta di cervello fino a 400 µm al fine di raggiungere un giusto compromesso tra vitalità del tessuto e connettività intrinseca. È infatti riconosciuto quel flusso laminare della soluzione di registrazione all’interno della camera è altamente desiderabile per elettrofisiologia del cervello fetta, poiché non è influenzato dalla temperatura, ossigeno, e gradienti di pH che si osservano nella circolare-flusso rotondo registrazione Colombo19,20,31 (come quelli forniti con MEA disponibile in commercio). Tali pendenze introducono sperimentale polarizzazione e sono anche dannose per la fetta di cervello. Alloggiamenti di registrazione di un volume relativamente piccolo (~1.5 mL) insieme a una perfusione ad alta velocità (5-6 mL/min)16,31 consentano adeguato scambio del mezzo aspersione (≥ 3 volte / min). La camera di personalizzato può essere facilmente ottenute da fonti commerciali ad un prezzo accessibile o prodotte internamente utilizzando tecnologia di stampa 3D. Altri studi hanno riferito le registrazioni MEA da 400 fette di cervello umano µm di spessore16 utilizzando la camera di cottura convenzionale MEA, mantenendo il volume ACSF a 1 mL e l’applicazione di un tasso elevato di aspersione (5-6 mL/min) con l’aiuto di una pompa peristaltica di basso rumore. Tuttavia, gli autori hanno utilizzato un diverso modello di ictogenesi, cioè, il basso Mg2 +, che è probabilmente che meno influenzata rispetto al modello 4AP ephaptic meccanismi che comportano un aumento significativo nella concentrazione extracellulare di K+ 11 , 22. abbiamo trovato che un tasso elevato di aspersione non è desiderabile nel modello 4AP, possibilmente dovuto il lavaggio veloce fuori di K extracellulare accumulato+, che potrebbe essere necessario essere aumentato significativamente nella registrazione ACSF16. Infatti, eventi ictal è sembrato più ‘blocchi’ quando ASCF aspersione velocità è stata aumentata a 2-3 mL/min e la fetta di cervello è stata sommersa da uno spesso strato ACSF, mentre scarichi conclamati espositrici robusti componenti tonico-clonic potrebbero essere ripristinati dopo il ritorno a un basso tasso di aspersione (1 mL/min) e una più sottile ACSF strato destra a livello superficiale del tessuto (dati non mostrati). La camera di registrazione personalizzato descritta in questo protocollo consente lo scambio il medium di perfusione 3 – 5 volte / min ad una portata di 1 mL/min. Così, il rifornimento di ossigeno complessiva per le fette di cervello è fortemente migliorato anche a tassi relativamente bassa perfusione, pur garantendo una stabile registrazione temperatura e alto rapporto segnale-rumore. La cosa più importante, è possibile mantenere la concentrazione extracellulare di K+ per un valore fisiologico.
Il modello 4AP di ictogenesi non richiede alcuna modifica significativa della composizione ionica ACSF, come abbassamento Mg2 + o crescente K+e offre un vantaggio unico di mantenere intatte le trasmissioni sia eccitatori che inibitori 12, un aspetto che è molto rilevante nella ricerca di epilessia alla luce del ruolo cruciale delle reti di neuroni GABAergici in sincronizzazione epileptiform (cfr. 7) e glutamatergic. Il 4AP-ACSF utilizzata nel presente protocollo contiene una concentrazione fisiologica di K+ (3,25 mM) e una Mg2 + concentrazione leggermente inferiore rispetto alla detenzione ACSF (1 mM contro 1,3 mM). Questa concentrazione ancora rientri nei valori fisiologici segnalati di concentrazione di Mg2 + nel roditore CSF e viene utilizzato in molti laboratori (Vedi ad esempio17,18). Lo scopo del protocollo descritto, abbiamo trovato che questa lieve diminuzione è preferita per aiutare nell’effetto di 4AP.
Nel precedente lavoro, 4AP è stato applicato per la fetta di cervello quando era già posizionato all’interno le registrazione camera17,18. A meno che lo sperimentatore deve osservare la latenza di tempo tra l’applicazione 4AP e l’insorgenza di epileptiform modelli, troviamo che questo approccio è piuttosto lungo e non è adatto a perseguire la registrazione prolungata e sedute di stimolazione descritto in questo protocollo. Pre-incubazione delle fette di cervello in 4AP a 32 ° C consente risparmiando tempo molto sperimentale, poiché fette del cervello possono essere pre-trattati della serie pur perseguendo l’esperimento utilizzando altre sezioni di tessuto.
La redditività prolungata delle fette del cervello può essere utile per analizzare le caratteristiche di rete nel lungo termine. Inoltre, la loro resilienza migliorata alla stimolazione elettrica ripetitiva è di grande vantaggio se lo sperimentatore vuole confrontare diversi protocolli di stimolazione, che devono essere eseguiti nella stessa fetta di cervello per robustezza statistica. Nelle nostre mani, quando 3 protocolli di stimolazione di prova, ciascuno preceduto da una fase di controllo e seguita da una fase di recupero, l’esperimento può durare 3-5 h. In questo contesto, mappe in tempo reale MEA è fondamentale al fine di attivare la via corretta e sopprimere, piuttosto che favorire ictogenesi tramite stimolazione elettrica. Il nostro user-friendly GUI rappresenta uno strumento rapido, semplice e flessibile per mappare gli elettrodi di strutture cerebrali differenti. Al contrario di software commerciale, è possibile aggiungere layout personalizzati MEA anche con competenze di programmazione di base. Immagini possono essere acquisite nel campo luminoso; così, qualsiasi fotocamera di uso generale che ha buona risoluzione e si inserisce su un microscopio è adatto. Un microscopio invertito è essenziale per visualizzare la posizione di microelettrodi rispetto la fetta di cervello, poiché questi sarebbero nascoste sotto il tessuto se si usa un microscopio in posizione verticale. Tuttavia, un impianto stereo-microscopio è consigliabile oltre al tipo invertito se lo sperimentatore deve eseguire tagli di coltello per interrompere specifici circuiti neuronali.
Infine, un ulteriore vantaggio dell’approccio proposto è l’Assemblea relativamente semplice ed economico della maggior parte degli strumenti necessari, come la camera di registrazione personalizzata e gli alloggiamenti di detenzione, il bagno caldo e l’ancoraggio di fetta, come pure l’uso inutile di un costoso pompa peristaltica a basso rumore.
Limiti della tecnica:
Registrazione di MEA non consente di visualizzare le onde molto lente, cioè, DC si sposta nel segnale. Tali deviazioni della linea di base possono aiutare a misura asintotica di scarico ictal durata e, più importante, sono fondamentali per lo studio di depressione di diffusione corticale (un fenomeno che riguarda la morte inattesa improvvisa nell’epilessia32 e viene condiviso tra l’epilessia ed emicrania33).
Per quanto riguarda neuromodulation elettrico, il protocollo qui descritto consente di effettuare diverse sessioni di stimolazione senza colpire l’attuabilità di fetta di cervello. Abbiamo potuto eseguire con successo fino a 3 sedute di stimolazione di 20-45 min, simile a quanto indicato nel precedente lavoro25. Anche se fette del cervello probabilmente possono sopportare un maggior numero di sessioni di stimolazione o protocolli di stimolazione più a lungo, abbiamo non prova fette del cervello a questo proposito. Si consiglia di limitare il numero di protocolli di stimolazione a 3 ed evitando prolungate sessioni di stimolazione (≥ 60 min), che possono significativamente lo stress del tessuto di cervello conservato in queste condizioni limite, fino alla mancanza di recupero al momento del ritiro di stimolo.
Fasi critiche all’interno del protocollo:
Diversi fattori critici possono ostacolare il riuscito inseguimento di registrazione e la modulazione dell’attività epileptiform in fettine di cervello accoppiato a MEA. Oltre la specie di roditori utilizzati e la qualità delle fette di cervello, il tasso di aspersione durante la registrazione e la dinamica del flusso ACSF (cioè., laminare contro circolare) all’interno della camera di registrazione, abbiamo trovato che le condizioni di recupero e manutenzione a lungo termine di fette del cervello così come la modalità di applicazione 4AP sono le fasi più critiche.
Quando si utilizza una camera sommersa è cruciale memorizzare le fette di cervello a temperatura ambiente per preservare le attività di rete di tessuto cerebrale e favoriscono l’induzione degli scarichi ictal-come da 4AP applicazione. Nelle nostre mani, recupero e manutenzione a 32 ° C si è deteriorato il tessuto cerebrale all’interno di 3-4 h di affettatura.
Incubazione del cervello fette in 4AP-ACSF a temperatura ambiente e registrazione a 32 ° C è, tuttavia, non auspicabile. Abbiamo trovato molte difficoltà nell’osservare gli scarichi ictal ricorrenti robusti in questa condizione. Infatti, basse temperature nell’intervallo 20-24 ° C sono state segnalate per smorzare o addirittura prevenire 4AP-indotto ictogenesi entrambi in vitro34 ed in vivodi35. Così, le temperature di incubazione e registrazione 4AP devono rientrare entro i 30-34 ° C e devono essere adeguate. Per evitare di mettere il tessuto cerebrale sotto troppo stress dovuto l’induzione simultanea di ipereccitabilità di 4AP e l’improvvisa esposizione delle fette del cervello dalla temperatura ambiente per il caldo (32 ° C) 4AP-ACSF, è fondamentale eseguire un pre-riscaldamento intermedio passo e lasciare che le fette di cervello habituate nell’azienda ACSF al 32 ° C per 20-30 min, saltare questo passaggio potrebbe influire sulla induzione di ictogenesi di 4AP.
Un altro aspetto che deve essere menzionato è l’importanza della concentrazione di D-glucosio nel ACSF dopo il taglio. Una concentrazione di 25 mM conserva le fette di cervello meglio di concentrazione 10 mM usata in molti laboratori e migliora anche il tasso di ricorrenza dell’attività convulsiva, che è 2 volte più veloce (, rendendo così più facile perseguire una lunga serie di sperimentale protocolli in parecchie fette di cervello ogni giorno).
Infine, alcuni importanti dettagli durante la procedura d’affettatura bisogno di essere menzionato. In primo luogo, non consentono il cervello intatto e le fette di cervello di congelare al freddo taglio ACSF. Agghiacciante il cervello per < 2 min è sufficiente date le piccole dimensioni del cervello del mouse. Sezioni di tessuto devono essere trasferite immediatamente da tampone per il risciacquo Becher a temperatura ambiente. Sciacquare il taglio ACSF è molto importante che altrimenti la concentrazione di saccarosio alta farà il cervello fette stick per la rete di nylon della camera della holding. Per sciacquare efficacemente il tessuto, è importante per ridurre al minimo il contenuto ACSF di taglio all'interno della pipetta di trasferimento in modo da non contaminare la detenzione ACSF eccessivamente. 2 stadi di risciacquo aiuta a minimizzare la contaminazione. Al completamento della procedura per affettare, sezioni di tessuto devono essere trasferite immediatamente dal risciacquo bicchieri alla camera di tenuta, dove il morbido nylon mesh sospesa a metà strada nell'azienda ACSF permette l'ossigenazione dei tessuti su entrambi i lati. Lo stesso principio deve essere applicato in tutte le fasi, seguendo la procedura per affettare: fettine di cervello non dovrebbero mai sedersi nella parte inferiore del bicchiere, non dovrebbero essere a contatto con i lati delle sezioni della holding e non dovrebbe mai essere in contatto tra loro, né si sovrappongono.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi:
ACSF composizione può essere modificata secondo le esigenze dello sperimentatore. Ad esempio, farmaci possono aggiungersi a sezionare il contributo di neurotrasmettitori specifici o scanalature dello ione per l’efficacia della neuromodulazione elettrica. Inoltre, piruvico e acido ascorbico (cfr. tabella 2) può essere omesso, anche se troviamo che esercitano un ruolo neuroprotective potenti. Segnaliamo in tabella 3 i problemi più comuni che si possono incontrare in questo protocollo e come trattare con loro.
CONCLUSIONI:
Registrazione di MEA è senza dubbio una tecnica insostituibile per affrontare le interazioni delle reti neuronali nella salute e nella malattia. Oltre a studi farmacologici, è anche possibile valutare il neuromodulation elettrico protocolli che sono rilevanti per DBS applicato a epilessia e altri disturbi neurologici. In questo protocollo, abbiamo indicato che è possibile riprodurre gli esperimenti di stimolazione periodica tipica con risultati simili a quelli ottenuti con la registrazione di potenziali di campo extracellulare convenzionale e gli elettrodi di stimolazione esterna. La crescente disponibilità di attrezzature di facile utilizzo e strumenti software avanzati rendono adatto anche per gli esperimenti di stimolazione del ciclo chiuso, per fornire lo stimolo ad hoc per il tessuto cerebrale e per la tecnica di registrazione di MEA studiare il contributo dei meccanismi di feedback alle risposte di rete di un neurone.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
G.P. è Marie Skłodowska-Curie Fellow finanziato dal progetto Unione europea MSCA-IF-2014 Re.B.Us, G.A. n.660689, nell’ambito del programma quadro H2020. La mapMEA GUI è liberamente disponibile su richiesta all’autore ilaria.colombi@iit.it.
Materials
| Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
| NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
| KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
| KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
| CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
| D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
| NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
| MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
| MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
| Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
| 4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
| STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
| MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
| planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
| McRack | Multichannel System | Recording software | |
| McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
| TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
| PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
| MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
| Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
| MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
| Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
| MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
| VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
| Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |
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