הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode
Summary
אנו מדגימים כיצד לבצע הקלטה וחשמליים מודולציה של פעילות אפילפטית 4-aminopyridine-induced פרוסות המוח מכרסמים באמצעות מערכי microelectrode. חדר הקלטה מותאמת אישית שומר על רקמות הכדאיות ברחבי מישיבות ניסיוני. חיים מיפוי אלקטרודה, מבחר זוגות מגרה מבוצעות על ידי ממשק משתמש גרפי מותאם אישית.
Abstract
אפילפסיה של האונה הרקתית (TLE) היא הנפוצה ביותר חלקית תסמונת אפילפטית מורכבים של תרופות קשוב לפחות. גירוי מוחי עמוק (DBS) היא גישה מבטיחה כאשר נכשלת טיפול תרופתי או כירורגי אינו מומלץ. פרוסות המוח חריפה מצמידים מערכים microelectrode (אותי) מייצגים כלי חשוב ללמוד הרשת העצבית אינטראקציות ו אפנון שלהם על ידי גירוי חשמלי. לעומת טכניקות הקלטה חוץ-תאית קונבנציונאלי, הם מספקים את היתרונות הוספה של מספר רב יותר של נקודות תצפית, מרחק בין אלקטרודה ידוע, אשר מאפשרים ללמוד את הפצת הנתיב ואת המהירות של אלקטרופיזיולוגיות אותות. עם זאת, רקמות חמצון עלול להיות לקוי במידה רבה במהלך MEA הקלטה, הדורש קצב גבוה זלוף, אשר מגיע על חשבון ירידה יחס אות לרעש, גבוה יותר תנודות הטמפרטורה ניסיוני. גירוי חשמלי נוסף מדגיש את רקמת המוח, ולכן קשה להתמיד שהשרתים הקלטה/גירוי ממושך. יתר על כן, חשמל מודולציה של פעילות מוחית פרוסה צריך למקד מבנים/מסלולים ספציפיים בתוך הפרוסה המוח, הדורש כי מיפוי אלקטרודה בקלות ובמהירות להתבצע חי במהלך הניסוי. כאן, אנחנו מדגימים כיצד לבצע את אפנון הקלטה וחשמליים של פמפרידין (4AP)-induced לפעילות אפילפטית פרוסות המוח מכרסמים באמצעות אותי מישוריים. אנו מראים כי רקמת המוח המתקבל עכברים outperforms חולדה רקמת המוח, ובכך מתאים יותר לניסויים MEA. פרוטוקול זה מבטיח הדור ואת התחזוקה של דפוס יציב אפילפטית בנאמנות מתרבה התכונות אלקטרופיזיולוגיות נצפתה עם הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי, נמשכת כמה שעות, ולא outlasts מתמשכת גירוי חשמלי במשך תקופות ממושכות. רקמות הכדאיות לאורך כל הניסוי מושגת בזכות השימוש של חדר הקלטה מותאמת אישית בנפח מצומצם ומאפשר זרימה שכבתית וחילופי פתרון מהיר אפילו ב נמוך (1 mL/min) המחירים זלוף. מיפוי מהיר MEA עבור ניטור בזמן אמת ומבחר של אלקטרודות מגרה מתבצע על ידי ממשק מותאם אישית משתמש גרפי (GUI).
Introduction
אפילפסיה הוא סכנת חיים הפרעה פרוגרסיבית גרימת פעילות בלתי מבוקרת של המוח1; הוא נושא בין הנטל הגבוה ביותר של המחלה ו-2,סטיגמה חברתית משמעותית3. TLE היא התסמונת בתדירות הגבוהה ביותר (40%) ואת ביותר לעתים קרובות (~ 30%) עמידים בפני תרופות אנטי-אפילפטי4. בזמן ניתוח אבלציה של הרקמה epileptogenic ייתכן להפחיתם מצבו של החולה, הוא הוא לא ריאלי של כל החולים, אינו מבטיח לחיים לחלוטין ללא פרכוס5. אפנון של אפילפסיה הלימבי רשתות על ידי DBS חשמל היא גישה מבטיחה טיפול תרופתי או כירורגי אינם מתאימים.
פרוסות המוח מכרסמים הם כלי חשוב ללמוד איך רשתות תפקוד מחלה ובריאות6 על-ידי במבחנה טכניקות אלקטרופיזיולוגיה, כפי שהם לשמר, לפחות חלק, באדריכלות המקורי ואת קישוריות של המוח region(s) עניין (ROI). בפרט, ההיפוקמפוס משולב אופקי-entorhinal קליפת המוח (היפוקמפוס-EC) פרוסות מהווים את רשתות עצביים חיוני מעורב TLE, לכן מועסקות באופן שגרתי במבחנה TLE מחקר7.
הפציינט יכול להיות בחריפות המושרה פרוסות המוח על-ידי שינוי ההרכב יוניים של הנוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד), כגון הפחתת מגנזיום תוך הגדלת אשלגן8,9,10, או באמצעות מניפולציות תרופתי, כגון חסימת מעכבות פעילות GABAergic (ראה11 עבור סקירה מקיפה). עם זאת, מודלים אלה מבוססים על משינוי לא מאוזן של עירור וניגוד; לפיכך, הם אינם מאפשרים ללמוד את האינטראקציה ואת התרומה מתואמת של רשתות סינאפסות כדי ictogenesis. זלוף רציפה של פרוסות המוח עם 4AP סמים convulsant משפר עצבית סינאפסות והן מעכבות, ובכך מאפשר ללמוד ictogenesis חריפה תוך שמירה בפעילות הסינפטית אוברול שלם12.
אותי לאפשר רישום הפעילות החשמלית שנוצרו על-ידי רשתות עצביים של מספר רב יותר של נקודות תצפית לעומת הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי חוץ-תאית, איפה הגבלות המרחבי להגביל את מספר אלקטרודות זה יכול להיות לאכלס על פני השטח פרוסה של המוח. יתר על כן, MEA שבבי מציעים יתרון נוסף של המרחק בין אלקטרודה ידוע, אשר הוא מאוד שימושי כדי לאתר הפצת, להעריך את מהירות הנסיעה של אותות המוקלט. אמנם בתחילה נוצר עבור הקלטה של נוירונים בתרבית13,14, אותי עכשיו משמשים גם כדי לאפיין את התכונות אלקטרופיזיולוגיות של פרוסות המוח חריפה המתקבל מכרסמים15 ועוד בני16. לכן, בהקשר של מחקר אפילפסיה, אותי מייצגים כלי רב ערך לאתר האינטראקציות של רשתות עצביים הליבה של17,ictogenesis16,18.
עם זאת, MEA הקלטה מטבעו נושא האתגרים הטכניים קבלת או שמירה על דפוס אפילפטית יציבה לאורך כל הפרוטוקולים ניסיוני ארוך (מספר שעות). ראשית, חמצון הרקמות עשוי לא להיות נאותה בתוך הגדול, עגול שקוע-type הקלטה קאמרית19,20 אופייני לי זמינים מסחרית, ואילו יחס אות לרעש המסכן וחוסר יציבות טמפרטורה עלול להשפיע איכות ההקלטה כאשר קצב זלוף גבוהה (6-10 mL/min) משמש כדי לשפר את אספקת החמצן כדי הפרוסה המוח (ראה לדוגמה את הערות טכניות על ציוד חימום זלוף21). שנית, חוזרים ונשנים הפרשות הכוללים רכיבים בתדירות גבוהה, כגון הפרשות אפילפטית, בקושי שנצפו בעת שימוש שקוע-type הקלטה צ’יימברס19; זה המקרה בעיקר כאשר התבנית אפילפטית חריפה הנגרמת כימית והיא כוללת מנגנונים ephaptic, כמו המקרה מודל 4AP22 (ראה11 עבור סקירה מקיפה). כדי להתגבר על מגבלות אלה, מספר אסטרטגיות הוצעו על ידי חוקרים. למשל, להגדיל את קצב זלוף19,20 תוך הפחתת עובי הפרוסה המוח (≤300 מיקרומטר) ואזור17,18 הם גורמים חיוניים להשגת אספקת חמצן מספקת לרקמות. בנוסף, המוח משופרת פרוסה הכדאיות יכול להתבצע גם באמצעות מחורר לי (pMEAs), אשר מאפשרים פרפוזיה על רקמת המוח של שני הצדדים18.
ואילו הגישות שתואר השתפרו באופן משמעותי את הכדאיות של מאה הקלטה של פרוסות המוח, הם לא נבדקו נגד ממושך (מספר שעות) הפעלות גירוי הקלטה וחשמליים, האחרון ייצוג משמעותי לחץ על רקמת המוח. מאולפן ההקלטות ממושך ועשוי להידרש ללמוד את ההתפתחות בזמן של תכונות ספציפיות של דפוסי אפילפטית לא יהיה ניתן לחשוף ע י מדידות לטווח קצר. בהקשר של מחקר DBS, פרוטוקולים ניסיוני הממושך עשוי להידרש כדי להעריך ולהשוות את ההשפעות של מספר גירויים פרדיגמות בתוך הפרוסה המוח באותו.
כאשר רק ספונטנית פעילות חשמלית צריך להיות מוקלטת, מיפוי של האלקטרודות ביחס רועי נעשית בדרך-כלל posteriori, קרי, במהלך ניתוח נתונים; במקום זאת, המחקר עורר תגובות או של פרדיגמות neuromodulation חשמל מחייב כי גירוי ניתן להעביר ROI(s) ספציפיים, מכתיב את הצורך של מיפוי מהיר וקל אלקטרודה בשידור חי במהלך הניסוי.
כאן, אנו ממחישים פרוטוקול ניסוי פשוט המאפשר אינדוקציה ותחזוקה של דפוס יציב אפילפטית 4AP-induced פרוסות המוח מכרסמים למבוגרים. הפעילות שנצפה מוליד בנאמנות את התכונות אלקטרופיזיולוגיות של מודל זה כמו מאופיין בשיטות קונבנציונליות אלקטרופיזיולוגיה חוץ-תאית. זה נמשך כמה שעות, outlasts גירוי חשמלי מתמשכת במשך תקופות ממושכות חוזרות ונשנות. התאים נהגו לשמור על דגירה את פרוסות המוח יכול להיות בקלות מורכבים בעזרת ציוד מעבדה סטנדרטיים (איור 1 א’), ואילו חדר הקלטה מותאם אישית המאפשר פתרון אופטימלי החליפין, זרימה שכבתית (איור 1B) יכול ניתן לקבל ממקורות מסחריים או באמצעות טכנולוגיית הדפסת תלת-ממד במחיר סביר. מיפוי מהיר ROI(s) עבור ניטור בזמן אמת, את הבחירה של אלקטרודות מגרה התאפשר על ידי GUI ידידותי למשתמש המותאם אישית בשם mapMEA, באופן חופשי זמין על פי בקשה.
איור 1: ציוד מותאם אישית עבור פרוטוקול זה. (א) החזקת צ’יימברס השחזור, מראש ההתחממות של דגירה מראש ב- 4AP הם מורכבים באמצעות גביע צלחת פטרי. הפטרי אמור להיות קטן בקוטר יותר החשמל, מתקיים במקום בעזרת פומפה מזרק. בתחתית הפטרי מוחלף על ידי רשת ניילון (מתוך גרבי רך) מודבקים עם דבק מגע על שפת הפטרי. החמצן המסופקת באמצעות כפופות מחט השדרה (22 גרם), מוכנס בין קירות הפטרי את הספל. בועות צריך העולה מן הצד של הספל, אף פעם לא להגיע רשת ניילון כדי למנוע תזוזה פרוסה המוח. החלק העליון של צלחת פטרי יכול לשמש מכסה כדי למנוע אידוי חנה המבר ולשמור רווית חמצן. חדר הקלטה מותאמת אישית (B). ב: כניסת המאגר כדי להכיל את הצינורית חימום, האלקטרודה הפניה. .: עודפים המאגר כדי להכיל את המחט היניקה. rec: הקלטת קאמרית. פיפטה (C) זכוכית פסטר, מכורבלת על ידי שיוף אש, המשמש כדי להתמודד עם הרקמה ולהתאים את מיקומו בתוך תא הקלטה. מותאם אישית (D) פרוסה hold-down עוגן. (E) ההרכבה הסופית של התא הקלטה רכוב על גבי השבב MEA. פרוסה המוח נשענת על גבי התחתון שנערך במקום על ידי העוגן. החץ האדום מציין את הצנרור PTFE המכסים את הצינורית חימום, ואילו העיגול האדום מציין האלקטרודה הפניה, גלולה אשלגן כלורי רווי שקוע מאת כלנית חדד במאגר כניסת המים. החץ הכחול מציין את המחט היניקה במאגר המים לשקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגיעו לבגרות בשנים האחרונות הודות עשורים של מחקר ופיתוח, הינם כלי רב ערך עבור חקירות נוירופיזיולוגיה אותי. לעומת הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי, מציעים לי היתרון הגדול של מספר גבוה יותר של נקודות תצפית, המרחק בין אלקטרודה ידוע, אשר מכריעים לאתר במדויק את הרשת העצבית אינטראקציות.
גם יכול להיות מצמידים את טכניקת הקלטה MEA גישות אחרות אלקטרופיזיולוגיה, כגון תיקון-קלאמפ הקלטה15, כדי לחקור את הקשר בין תא עצב אחד ופעילות הרשת העצבית. יתר על כן, האפשרות להצגה חזותית שדה פוטנציאל ופעילות יחידת מרובות בו-זמנית של יכול לספק תובנות יקרות הקשר בין הפעילות של הרכבים עצביים קטן לבין רשתות עצביים קולקטיבית. השילוב עם צבעי מתח רגיש, הדמיית סידן optogenetics29 מאפשר מסיקים נוירופיזיולוגיה התופעות בעזרת גישות לכל מקרה. בנוסף מחקרים, הופך האפשרות של ביצוע הקלטה וגם גירוי עם אותה מערכת הטכניקה הקלטה MEA חזק מאוד תכליתי: לדוגמה, זה אפשרי ללמוד את תופעת הפלסטיות הסינפטית- הליבה של זיכרון צורה30, באמצעות פרוטוקולים neuromodulation המובאים כאן, רלבנטיות DBS לטיפול אפילפסיה ועוד מגוון רחב של הפרעות מוח. ההוכחה האחרונה כי ניתן להחיל בהצלחה טכניקת הקלטה MEA על רקמת המוח האנושי אפילפסיה16 מדגים תועלתו לא בפז במחקר אפילפסיה, שניהם כדי להבין את המנגנונים הבסיסיים המחלה ההרסנית הזאת ולדייק DBS אלגוריתמים דהוא זה.
עם זאת, לי כוח המרדף אלקטרופיזיולוגיה ניסויים בתנאים ‘הגבל’ עבור פרוסות המוח, עקב הדרישה של חדר הקלטה המשוקע ולצורך לתת למוח לחתוך את השאר על מצע מוצק איפה המיקרו-האלקטרודות משולבים. לפיכך, רקמת המוח לא מקבלות אספקת חמצן נאותה, אשר בתורו עלול להשפיע על איכות ההקלטות.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר להקליט באופן אמין וללמוד ictogenesis ברשתות הלימבי מכרסמים, מצמידים מרעה באמצעות מודל חריפה 4AP במבחנה כדי לרדוף אחרי תקופות ממושכות של גירוי חשמלי, המספקות מידע רלוונטי על הערכה הפוליסות DBS.
מחקרים קודמים על חשמל neuromodulation מרשתות הלימבי אפילפטי, בהתבסס על השימוש של הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי השתמשו פרוסות המוח או עכבר או חולדה עם24,דומה תוצאות25; אבל השימוש של רקמת המוח עכברוש הוכיח יותר מאתגר, באופן סביר עקב קישוריות חלש יותר לעומת רקמת המוח המתקבל עכברים7. לגבי הטכניקה MEA, פרוסות המוח העכבר הם המתאימים ביותר בשל גודלם הקטן יותר. יתר על כן, בהינתן שיעור גבוה יותר של מופע של הפרשות כמו התקפי. עכבר לעומת רקמת המוח החולדה, זה אפשרי לבדוק פרוסות המוח יותר באופן משמעותי במהלך יום אחד ניסיוני, אשר בתורו גורם איסוף נתונים יעילה ומהירה, יכול להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים.
משמעות לגבי שיטות קיימות:
הפרשות התקפי. הוקלט באמצעות תא מותאם אישית המתוארים כאן מופיעים דומים ב משך וקצב של התרחשות לאלה שנמדדו באמצעות תא טבעת MEA קונבנציונלי ו- MEA מאותו סוג (מיקרו-אלקטרודות מישורי, cf. 17). עם זאת, זה צריך להדגיש כי עובי הפרוסה המוח חייב להיות משמעותית בעת שימוש לחדר ההקלטה עגול קונבנציונאלי יחד עם שיעור נמוך זלוף (1 מ”ל לדקה), אשר עלול להפריע המרדף מוצלחת של neuromodulation ניסויים עקב כדי קישוריות המסכן.
פרוטוקול זה, חדר הקלטה מותאמת אישית בנפח נמוך בהשראת תיקון-קלאמפ הקלטה קאמרית עיצוב מספקת זרימה שכבתית אמינה ויציבה, זה חיוני עבור המרדף מוצלחת של הקלטות MEA; זה גם מאפשר להגדיל את עובי הפרוסה המוח מיקרומטר 400 על מנת להשיג פשרה הוגנת בין רקמות הכדאיות וקישוריות מהותי. הוא אכן מוכר זה זרימה שכבתית של הפתרון הקלטה בתוך התא הוא רצוי מאוד עבור המוח פרוסה אלקטרופיזיולוגיה, כיוון זה אינו מושפע טמפרטורה, חמצן, מעברי pH הם נצפו circular זרימה סביב הקלטת צ’יימברס19,20,31 (כמו אלה סיפק לי זמינים מסחרית). מעברי צבע כזה גורם להטיה ניסיוני, פוגמים גם לחתוך המוח. הקלטה לשכות נפח קטן יחסית (~1.5 מ”ל) יחד עם16,קצב (5-6 mL/min) זלוף גבוה31 לאפשר לחילופי נאותה של המדיום זלוף (≥ 3 פעמים / min). החדר מותאם אישית יכול להיות בקלות שהושג ממקורות מסחריים במחיר סביר או יוצרו בחברה באמצעות טכנולוגיית הדפסת תלת-ממד. מחקרים אחרים דיווחו לי הקלטות מ 400 המוח האנושי מיקרומטר בעובי פרוסות16 באמצעות תא טבעת MEA קונבנציונאלי, תוך שמירה על אמצעי האחסון כלנית חדד מ ל 1 ואכיפת שיעור זלוף גבוהה (5-6 mL/min) בעזרת משאבה סחרור רעש נמוכה. עם זאת, המחברים השתמשו דגם אחר של ictogenesis, כלומר, את נמוכה מ ג2 +, אשר סביר שפחות מושפע מאשר הדגם 4AP ephaptic מנגנונים מעורבים עליות משמעותיות בריכוז K+ חוץ-תאית 11 , 22. מצאנו כי שיעור גבוה זלוף אינה רצויה במודל 4AP, כנראה עקב בכביסה מהר החוצה של K חוץ-תאית שהצטברו+, אשר ייתכן צריך להיות גדל באופן משמעותי בהקלטה כלנית חדד16. למעשה, אירועי התקפי. הופיע יותר ‘מקוטע’ כאשר מהירות זלוף ASCF הוגדל ל 2-3 mL/min הפרוסה המוח שקעה על ידי חנה המבר שכבה עבה, ואילו הפרשות במלוא מובן המילה מציג רכיבי טוניק-clonic חזקים יכול להיות משוחזר על החזרה קצב זלוף נמוך יותר (1 מ”ל לדקה), חנה המבר דק יותר של שכבה ממש על פני השטח רקמות (נתונים לא מוצג). תא הקלטה מותאמת אישית שמתואר פרוטוקול זה מאפשר להחלפת המדיום זלוף 3 – 5 פעמים / min בספיקה של 1 מ”ל לדקה. לפיכך, אספקת החמצן הכוללת לפרוסות המוח בחום משופרת אפילו במחירים זלוף נמוכה יחסית, תוך שמירה עדיין יציבה מקליט טמפרטורה, יחס אות לרעש גבוה. והכי חשוב, זה אפשרי לשמור על ריכוז K+ חוץ-תאית לערך פיזיולוגיים.
המודל 4AP של ictogenesis לא דורשת כל שינוי משמעותי של הרכב יוניים כלנית חדד, כגון Mg להורדת2 + או הגדלת K+, ומציע את היתרון הייחודי של שמירה על שידורי סינאפסות והן מעכבות ללא פגע 12, היבט זה מאוד רלוונטי במחקר אפילפסיה לאור תפקיד מכריע הן glutamatergic והן GABAergic רשתות בסנכרון אפילפטית (cf. 7). בשימוש פרוטוקול זה 4AP-חנה המבר מכיל ריכוז K+ פיזיולוגית (3.25 מ מ) מ ג2 + ריכוז נמוך במקצת מאשר החזקת כלנית חדד (1 מ”מ לעומת 1.3 מ’מ). ריכוז זה עדיין נופל בתוך הערכים פיזיולוגיים המדווחת של Mg2 + ריכוז למכרסמים CSF, זה משמש במעבדות רבות (ראה לדוגמה17,18). המטרה של הפרוטוקול המתואר, מצאנו כי זו ירידה קלה מועדף כדי לסייע האפקט של 4AP.
בעבודה הקודמת, 4AP הוחלה על הפרוסה המוח כאשר הוא הוצב כבר בתוך הקלטת קאמרית17,18. אלא אם כן הנסיין צריך להתבונן ההשהיה הזמן בין תחילת אפילפטית דפוסי היישום 4AP, נמצא כי גישה זו הוא במקום זמן רב ואינה מתאימה לרדוף את ההקלטה ממושך והפעלות גירוי תיאר ב פרוטוקול זה. קדם דגירה של פרוסות המוח 4AP ב 32 ° C מאפשר ממעט זמן הניסוי הרבה, מאז פרוסות המוח יכול להיות טרום שטופלו בסדרה תוך כדי לרדוף אחרי הניסוי באמצעות סעיפים אחרים רקמות.
הכדאיות ממושך של פרוסות המוח עשוי להיות שימושי לנתח תכונות רשת לטווח הארוך. יתר על כן, העמידות שלהם משופר החוזרות על עצמן גירוי חשמלי הוא יתרון גדול אם הנסיין רוצה להשוות בין מספר פרוטוקולים גירוי, אשר חייב להתבצע בתוך הפרוסה המוח זהה עבור חוסן סטטיסטי. בידיים שלנו, בעת בדיקת הפרוטוקולים גירוי 3, אחד ולפניהם שלב הבקרה, בעקבות שלב ההתאוששות, הניסוי יימשך 3-5 שעות. בהקשר זה, מיפוי MEA חיים חיונית על מנת להפעיל את השביל הנכון ועל העלם ולא טובה ictogenesis באמצעות גירוי חשמלי. GUI ידידותי למשתמש שלנו מייצג כלי מהיר, פשוט וגמיש כדי למפות את האלקטרודות של מבנים שונים במוח. בניגוד תוכנה מסחרית, זה אפשר להוסיף פריסות מותאמות אישית MEA אפילו עם ידע בתכנות בסיסי. ניתן לרכוש תמונות בשדה בהיר; לפיכך, כל מצלמה למטרה כללית יש רזולוציה טובה, מתאים מיקרוסקופ מתאימה. מיקרוסקופ הפוכה חיונית כדי להמחיש את המיקום microelectrodes ביחס הפרוסה המוח, שכן אלו מוסתרים מתחת לרקמת אם באמצעות מיקרוסקופ זקוף. עם זאת, סטריאו-המיקרוסקופ מומלץ בנוסף הסוג ההפוך אם הנסיין צריך לבצע סכין-חתכים לשבש מסלולים עצביים מסוימים.
לבסוף, יתרון נוסף של הגישה המוצעת היא מכלול זול וקל יחסית של רוב הכלים הנדרשים, כמו תא הקלטה מותאמת אישית של הצ’יימברס אחזקות, באמבט החמים העוגן פרוסה, וכן שימוש מיותר יקר משאבת סחרור רעש נמוכה.
מגבלות של הטכניקה:
הקלטה MEA אינו מאפשר להמחיש גלים איטיים מאוד, קרי, DC משמרות בתוך האות. Deflections בסיסית כזה עשוי לסייע מדידה אסימפטוטית של התקפי פריקה משך והוא, והכי חשוב, הם היסוד ללמוד דיכאון מתפשטת בקליפת המוח (תופעה מתייחס למוות פתאומי בלתי צפוי ב אפילפסיה32 משותפת בין אפילפסיה ומיגרנה33).
לגבי neuromodulation חשמל, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשרת ביצוע מספר מפגשים גירוי מבלי להשפיע על המוח פרוסה הכדאיות. בהצלחה שיכולנו לבצע עד 3 מפגשים גירוי בני 20-45 דקות, דומה מה לדווח העבודה הקודמת25. למרות פרוסות המוח עשוי כנראה לעמוד מספר גבוה יותר של הפעלות גירוי או פרוטוקולים גירוי יותר זמן, אנחנו לא בדק פרוסות המוח בהקשר זה. אנו ממליצים על הגבלת מספר פרוטוקולים גירוי 3 והימנעות ממושכת הפעלות גירוי (≥60 דקות), אשר באופן משמעותי עלול להדגיש את רקמת המוח נשמר בתנאים אלה מגבלת ‘, עד חוסר התאוששות על גירוי נסיגה.
שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול:
מספר גורמים קריטיים עשויה לעכב המרדף מוצלחת של הקלטה, מודולציה של פעילות אפילפטית פרוסות המוח מצמידים MEA. מלבד המינים מכרסמים בשימוש, האיכות את פרוסות המוח, קצב זלוף במהלך ההקלטה ואת הדינמיקה של הזרם כלנית חדד (כלומר., למינריות לעומת מעגלי) בתוך התא הקלטה, אנחנו מצאו כי התנאים של התאוששות, תחזוקה לטווח הארוך של פרוסות המוח, כמו גם המצב של יישום 4AP הם הצעדים הקריטיים ביותר.
בעת שימוש בתא המעצר המשוקע זה הכרחי לאחסן את פרוסות המוח בטמפרטורת החדר כדי לשמר פעילות רשת של רקמת המוח וחסדך של אינדוקציה של הפרשות כמו התקפי. על-ידי יישום 4AP. בידיים שלנו, שחזור ותחזוקה -32 מעלות צלזיוס התדרדרה על רקמת המוח בתוך 3-4 h ששיספתי.
דגירה של המוח פרוסות ב- 4AP-חנה המבר בטמפרטורת החדר, הקלטה ב 32 ° C, אולם הוא לא רצוי. מצאנו בקשיים רבים התבוננות חזקים הפרשות התקפי חוזרים ונשנים במצב הזה. אכן, טמפרטורות נמוכות בטווח 20 – 24 ° C דווחו לצנן או אפילו למנוע ictogenesis 4AP-induced שני חוץ גופית בתוך34 ו ויוו35. לפיכך, הטמפרטורות הקלטה של דגירה 4AP חייב ליפול בתוך 30-34 ° C, חייב להיות מתאימים. כדי להימנע לשים על רקמת המוח תחת לחץ עקב אינדוקציה סימולטני של אי-שקט על פי 4AP, חשיפה פתאומית של פרוסות המוח של טמפרטורת החדר כדי 4AP חמים (32 ° C)-חנה המבר, זה הבסיס לביצוע של ביניים מראש התחממות כדור הארץ שלב ולתת שפרוסות המוח habituate במעצר כלנית חדד-32 מעלות צלזיוס במשך 20-30 דק. דילוג על שלב זה עלול להשפיע על אינדוקציה ictogenesis על ידי 4AP.
היבט נוסף צריך להיות מוזכר הוא החשיבות של D-גלוקוז ריכוז כלנית חדד לאחר חיתוך. ריכוז 25 מ מ משמרת את פרוסות המוח טוב יותר הריכוז 10 מ”מ בשימוש במעבדות רבים של גם משפר את שיעור ההתרחשות של פעילות התקפי, אשר 2-fold מהר יותר (לכן, ובכך להקל על לרדוף אחרי סדרה ארוכה של ניסויים פרוטוקולים המוח מספר פרוסות בכל יום).
לבסוף, כמה פרטים חשובים בסדר במהלך ההליך עם פרוסות צריך להיות מוזכר. ראשית, אל תאפשר המוח ללא פגע, את פרוסות המוח לקפוא בקור חיתוך כלנית חדד. מצמרר המוח עבור < 2 דקות מספיקה נוכח היקפה המצומצם של המוח העכבר. מקטעי רקמת צריך להעביר מיד ממגש מאגר בקבוקונים השטיפה בטמפרטורת החדר. שטיפה החיתוך כלנית חדד הוא מאוד חשוב שאחרת הריכוז סוכרוז גבוה יגרום המוח פרוסות לדבוק רשת ניילון של תא המעצר. לשטוף ביעילות את הרקמה, חשוב למזער את התכנים חנה המבר חיתוך פיפטה העברה כדי לא לזהם את החזקת חנה המבר יתר על המידה. 2-שלב השטיפה מסייעת למזער את הזיהום. עם סיומו של ההליך עם פרוסות, מקטעי רקמת יש להעביר מיד מ בקבוקונים השטיפה לתא המעצר, איפה הניילון רך mesh מושעה במחצית הדרך במעצר חנה המבר מאפשר חמצון הרקמות משני הצדדים. אותו עיקרון צריך להיות מיושם בכל שלבי ביצוע שלבי ההליך עם פרוסות: פרוסות המוח אף פעם לא צריכה לשבת בתחתית הספל, הם לא צריכים להיות בקשר עם צדי הצ'יימברס אחזקות, הם לא צריך להיות בקשר עם אחד את השני ולא חופפים.
שינויים, פתרון בעיות:
הרכב חנה המבר ניתן לשנות על פי הצרכים של הנסיין. לדוגמה, ניתן להוסיף תרופות לנתח את התרומה של נוירוטרנסמיטורים מסוימים או תעלות יונים על היעילות של neuromodulation חשמל. יתר על כן, pyruvic וחומצה אסקורבית (.cf. בטבלה 2) עשוי להיות מושמט, למרות שנמצא כי הם מפעילים תפקיד neuroprotective עוצמה. . מדווחים בטבלה 3 הבעיות הנפוצות ביותר שניתן נתקל ב פרוטוקול זה וכיצד להתמודד איתם.
מסקנות:
הקלטה MEA הוא ללא ספק טכניקה שלא יסולא בפז לפנות את האינטראקציות של רשתות עצביים על בריאות ומחלה. בנוסף מחקרים, זה גם אפשרי להעריך פרוטוקולים neuromodulation חשמל הרלוונטיים DBS חלה על אפילפסיה והפרעות נוירולוגיות אחרות. ב פרוטוקול זה, אנחנו הראו כי זה אפשר לשחזר את גירוי תקופתי טיפוסי ניסויים עם תוצאות דומות לאלו שהושגו עם הקלטה פוטנציאליים שדות קונבנציונלי חוץ-תאית וחיצוניים מגרה אלקטרודות. הזמינות הגוברת של ציוד מסחרי ידידותי למשתמש, כלי תוכנה מתקדמים להפוך את טכניקת הקלטה MEA מתאים גם לניסויים לולאה סגורה גירוי, גירוי אד הוק לרקמת המוח, וכדי לספק לחקור את התרומה של מנגנוני משוב תגובות הרשת העצבית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ג. פ הוא עמית הספרותמוזאון מארי במימון הפרויקט האיחוד האירופי MSCA-אם-2014 Re.B.Us, n.660689 לשכניו, במסגרת התוכנית מסגרת H2020. MapMEA GUI זמין באופן חופשי על פי בקשה לעריכת ilaria.colombi@iit.it.
Materials
| Poly-D-Lysine | Sigma-Adrich | P7886 | Needed for MEA coating |
| NaCl | Sigma-Adrich | S9888 | Chemical |
| KCl | Sigma-Adrich | P9541 | Chemical |
| KH2PO4 | Sigma-Adrich | 795488 | Chemical |
| CaCl2*2 H2O | Sigma-Adrich | C3306 | Chemical |
| D-Glucose | Sigma-Adrich | RDD016 | Chemical |
| NaHCO3 | Sigma-Adrich | S5761 | Chemical |
| MgCl2*6 H2O | Sigma-Adrich | M2670 | Chemical |
| MgSO4*6 H2O | Sigma-Adrich | M5921 | Chemical |
| Sucrose | Sigma-Adrich | RDD023 | Chemical |
| Pyruvic Acid, 98% | Sigma-Adrich | 107360 | Chemical |
| 4-aminopyridine | Sigma-Adrich | A78403 | Convulsant drug |
| STG-2004 | Multichannel System | STG4004-1.6mA | 4-channel stimulus generator with voltage (±8 V) and current output (±1.6 mA) |
| MEA1060 | Multichannel System | N/A | MEA amplifier |
| planar MEA | Multichannel System | 60MEA500/30iR-Ti w/o ring | Must be without ring to allow using the custom recordingchamber |
| McRack | Multichannel System | Recording software | |
| McStimulus II | Multichannel System | STG4004 control software | |
| TC02 | Multichannel System | TC02 | 2-channel thermostat |
| PH01 | Multichannel System | PH01 | Heating perfusion canula |
| MPH | Multichannel System | MPH | Magnetic holder for PH01 and suction needle |
| Elastostil E43 | Wacker | E43 | Elastomeric sealant used to mount the custom recording chamber onto the MEA |
| MEA Custom Chamber | Crisel Instrument | SKE-chamber MEA | Custom recording chamber |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 1.0 mm | Crisel Instrument | 64-1309 | Reference electrode for the custom recording chamber |
| Tergazyme | Sigma-Adrich | Z273287-1EA | Enzymatic cleaner |
| MATLAB | The Mathworks | Programming environment for electrodemapping | |
| VT1000S | Leica Biosystems | VT1000S | Vibratome |
| Warner Instruments | 64-1309 | Ag-AgCl Electrode Pellet 1.0 mm (E205). Reference electrode. |
References
- Fisher, R. S., et al. Operational classification of seizure types by the International League Against Epilepsy: Position Paper of the ILAE Commission for Classification and Terminology. Epilepsia. 58 (4), 522-530 (2017).
- WHO. . Epilepsy Facts Sheet. , (2017).
- Fiest, K. M., Birbeck, G. L., Jacoby, A., Jette, N. Stigma in epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 14 (5), 444 (2014).
- Brodie, M. J., Barry, S. J., Bamagous, G. A., Norrie, J. D., Kwan, P. Patterns of treatment response in newly diagnosed epilepsy. Neurology. 78 (20), 1548-1554 (2012).
- Tanriverdi, T., Poulin, N., Olivier, A. Life 12 years after temporal lobe epilepsy surgery: a long-term, prospective clinical study. Seizure. 17 (4), 339-349 (2008).
- Dingledine, R. . Brain slices. , (1984).
- Avoli, M., et al. Network and pharmacological mechanisms leading to epileptiform synchronization in the limbic system in vitro. Prog Neurobiol. 68 (3), 167-207 (2002).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. Epileptiform activity induced by changes in extracellular potassium in hippocampus. J Neurophysiol. 54 (5), 1363-1374 (1985).
- Mody, I., Lambert, J. D., Heinemann, U. Low extracellular magnesium induces epileptiform activity and spreading depression in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 57 (3), 869-888 (1987).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nat Neurosci. 14 (5), 627-634 (2011).
- Pitkanen, A. . Models of seizures and epilepsy. , (2017).
- Rutecki, P. A., Lebeda, F. J., Johnston, D. 4-Aminopyridine produces epileptiform activity in hippocampus and enhances synaptic excitation and inhibition. J Neurophysiol. 57 (6), 1911-1924 (1987).
- Gross, G. W., Rieske, E., Kreutzberg, G. W., Meyer, A. A new fixed-array multi-microelectrode system designed for long-term monitoring of extracellular single unit neuronal activity in vitro. Neurosci Lett. 6 (2-3), 101-105 (1977).
- Pine, J. Recording action potentials from cultured neurons with extracellular microcircuit electrodes. J Neurosci Methods. 2 (1), 19-31 (1980).
- Reinartz, S., Biro, I., Gal, A., Giugliano, M., Marom, S. Synaptic dynamics contribute to long-term single neuron response fluctuations. Front Neural Circuits. 8, 71 (2014).
- Dossi, E., Blauwblomme, T., Nabbout, R., Huberfeld, G., Rouach, N. Multi-electrode array recordings of human epileptic postoperative cortical tissue. J Vis Exp. (92), (2014).
- Boido, D., et al. Cortico-hippocampal hyperexcitability in synapsin I/II/III knockout mice: age-dependency and response to the antiepileptic drug levetiracetam. Neuroscience. 171 (1), 268-283 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. The 4-aminopyridine in vitro epilepsy model analyzed with a perforated multi-electrode array. Neuropharmacology. 60 (7-8), 1142-1153 (2011).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Ivanov, A., Zilberter, Y. Critical state of energy metabolism in brain slices: the principal role of oxygen delivery and energy substrates in shaping neuronal activity. Front Neuroenergetics. 3, 9 (2011).
- MultichannelSystems. . Manual PH01. , (2018).
- Zhang, M., et al. Propagation of epileptiform activity can be independent of synaptic transmission, gap junctions, or diffusion and is consistent with electrical field transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
- Panuccio, G., et al. In vitro ictogenesis and parahippocampal networks in a rodent model of temporal lobe epilepsy. Neurobiol Dis. 39 (3), 372-380 (2010).
- Barbarosie, M., Avoli, M. CA3-driven hippocampal-entorhinal loop controls rather than sustains in vitro limbic seizures. J Neurosci. 17 (23), 9308-9314 (1997).
- Panuccio, G., Guez, A., Vincent, R., Avoli, M., Pineau, J. Adaptive control of epileptiform excitability in an in vitro model of limbic seizures. Exp Neurol. 241, 179-183 (2013).
- Benini, R., Avoli, M. Rat subicular networks gate hippocampal output activity in an in vitro model of limbic seizures. J Physiol. 566 (Pt 3), 885-900 (2005).
- D’Arcangelo, G., Panuccio, G., Tancredi, V., Avoli, M. Repetitive low-frequency stimulation reduces epileptiform synchronization in limbic neuronal networks. Neurobiol Dis. 19 (1-2), 119-128 (2005).
- Steidl, E. M., Neveu, E., Bertrand, D., Buisson, B. The adult rat hippocampal slice revisited with multi-electrode arrays. Brain Res. 1096 (1), 70-84 (2006).
- Pulizzi, R., et al. Brief wide-field photostimuli evoke and modulate oscillatory reverberating activity in cortical networks. Sci Rep. 6, 24701 (2016).
- Liu, M. G., Chen, X. F., He, T., Li, Z., Chen, J. Use of multi-electrode array recordings in studies of network synaptic plasticity in both time and space. Neuroscience Bulletin. 28 (4), 409-422 (2012).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4 (9), e6925 (2009).
- Aiba, I., Noebels, J. L. Spreading depolarization in the brainstem mediates sudden cardiorespiratory arrest in mouse SUDEP models. Sci Transl Med. 7 (282), 282ra246 (2015).
- MA, R., Avoli, M., Noebels, J. L., Rogawski, M. A. . Jasper’s Basic Mechanisms of the Epilepsies . , (2012).
- Motamedi, G. K., et al. Termination of epileptiform activity by cooling in rat hippocampal slice epilepsy models. Epilepsy Res. 70 (2-3), 200-210 (2006).
- Yang, X. F., Duffy, D. W., Morley, R. E., Rothman, S. M. Neocortical seizure termination by focal cooling: temperature dependence and automated seizure detection. Epilepsia. 43 (3), 240-245 (2002).
