Изоляция и характеристика внеклеточного везикулы от взрослых Schistosoma японский
Summary
Здесь мы представляем протокол для описания изоляции внеклеточного везикулы (EVs) в в vitro культурной среде от взрослых Schistosoma японский.
Abstract
Внеклеточные везикулы (EVs) являются мембранные везикулы, выпущенная различных клеток в внеклеточной микроокружения. EVs представляют население гетерогенных везикулы, чей размер диапазона от 40 до 1000 Нм. Накопленных доказательств указал, что EVs играют важную роль регулирования в возбудитель хост взаимодействий. Глубокое понимание schistosome EVs должны обеспечить понимание механизмов лежащие в основе взаимодействия schistosome хост, позволяя развития новых стратегий по борьбе с шистосомозом. Здесь мы стремимся дальнейшего изучения функций EVs в шистосомоз, представив протокол для изоляции и характеристика EVs от взрослых Schistosoma японский (S. Японский). EVs были изолированы от в vitro питательной среды с помощью центрифугирования, в сочетании с комплектом изоляции коммерческих exosome. Изолированные S. Японский EVs (SjEVs) обычно обладают диаметром 100-400 Нм и характеризуются просвечивающей электронной микроскопии и Западный blotting. Использование PKH67 краска меченых SjEVs продемонстрировал, что SjEVs относить на счет получателя клетки. В целом наш протокол предоставляет альтернативный метод для изоляции EVs от взрослых шистосомоз; изолированные SjEVs могут быть пригодны для функционального анализа.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EVs) являются население малых мембраны прыгните везикулы, инкапсулированный с различными белки, липиды и нуклеиновых кислот. Недавние исследования показали, что EVs играют решающую роль в ячейке коммуникации и участвуют в регуляции многих физиологических процессов, включая развитие клеток, иммунных регулирование, ангиогенез и клеток миграции2, 3,4,5. Накопление доказательств показывает, что EVs, циркулирующих exosomes, а их груз, Мирна представляет потенциальные biomarkers некоторых заболеваний6.
Несколько простейших как Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziи лейшмании spp., показали, чтобы иметь возможность выделять EVs; Дополнительно были обнаружены глисты выделяют EVs в жизни хостов7. Было показано, что паразитарные EVs участвовать в поддержании инфекции, патогенности8и иммунных правила9. Последние исследования в шистосомоз 10,оба Schistosoma mansoni (S. mansoni)11 и12 S. Японскийуказали, что взрослый шистосомоз выделяют exosome как пузырьки, которые могут быть участие в функциональных положений конкретных биологических процессов.
На сегодняшний день, были использованы несколько методов изолировать внеклеточного везикулы, таких как ultracentrifugation, ультрафильтрация13, использование реагентов на полимерной основе, размер-гель-проникающей хроматографии и immunoaffinity изоляции. Эти различные методы имеют свои собственные преимущества и ограничения14. Как правило ultracentrifugation считается золотым стандартом метод для изоляции везикул. Однако этот метод страдает от ограничения потенциальных EV агрегации14.
Шистосомоз, пару методов были зарегистрированы для изоляции EV: к ним относятся ultracentrifugation11,12,10 и использование коммерческих EV изоляции комплект16 в несколько этапов (16яйца, schistosomula11, Взрослый шистосомоз10,12,17). Учитывая, что микровезикулы имеют широкий спектр размером от нескольких сотен нанометров до тысяч нанометров, мы разработали альтернативный метод, который сочетает в себе использование скамейке центрифуги, ультрафильтрации и коммерческих EV изоляции комплект изолировать EVs от Взрослый Schistosoma японский. Изолированные EVs обычно обладают диаметром 100-400 Нм и были успешно внедрено клетками получателя.
Protocol
Representative Results
Discussion
Недавние исследования по EVs показали, что schistosome, которую EVs играют важную роль в хост возбудитель взаимодействия3,9,12,16. Для дальнейшего решения своих нормативных функций, важно изолировать EVs от шистосомоз. Здесь мы оп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было, в части или в целом, поддержке национальных естественных наук фонд Китая (31472187 и 31672550) и сельскохозяйственной науки и технологии инновации программа Китайской академии сельскохозяйственных наук.
Materials
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 | |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
