Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum
Summary
Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van extracellulaire blaasjes (EVs) isolatie in in vitro gekweekte medium uit volwassen Schistosoma japonicum.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn membraanachtig blaasjes uitgebracht door een aantal van de cellen in de extracellulaire communicatie. EVW vertegenwoordigen een bevolking van heterogene blaasjes, waarvan groottewaaier tussen 40 en 1000 nm. Geaccumuleerde bewijs aangegeven dat EVs spelen een belangrijke regelgevende rol in pathogene agens-gastheer interacties. Een diep begrip van Schistosoma EVW moet inzicht verwerven in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de Schistosoma-gastheer interacties, ontwikkeling van nieuwe strategieën tegen schistosomiasis. Hier, streven wij naar verdere studie EVs functies in schistosomes door de presentatie van een protocol voor de isolatie en de karakterisering van het EVW van volwassen Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVW werden geïsoleerd van in vitro cultuur medium gebruik van centrifugeren gecombineerd met een commerciële exosome isolatie kit. De geïsoleerde S. japonicum EVs (SjEVs) doorgaans bezitten een diameter van 100-400 nm en worden gekenmerkt door transmissie elektronische microscopie en het westelijke bevlekken. Het gebruik van PKH67 kleurstof-geëtiketteerden SjEVs heeft aangetoond dat SjEVs door de ontvangende cellen zijn geïnternaliseerd. Over het geheel genomen biedt onze protocol een alternatieve methode voor het isoleren van EVs van volwassen schistosomes; de geïsoleerde SjEVs mogelijk geschikt voor functionele analyse.
Introduction
Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn een bevolking van kleine membraan-gebonden blaasjes ingekapseld en verschillende eiwitten, lipiden, nucleïnezuren. Recente studies aangetoond dat de EVs een cruciale rol in de cel-cel communicatie, en betrokken bij de regulering van tal van fysiologische processen zijn, met inbegrip van cel ontwikkeling, immuunregulatie, angiogenese en cel migratie2, 3,4,5. Vergaren van bewijs geeft aan dat de EVs, circulerende exosomes, en hun lading miRNA mogelijke biomarkers voor bepaalde ziekten6vertegenwoordigt.
Verschillende protozoa zoals Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzien Leishmania spp., hebben aangetoond te kunnen afscheiden van EVs; wormen zijn bovendien bevonden om afscheiden van EVW in levende gastheren7. Betrokken te worden bij de handhaving van de infectie, pathogeniteit8en9van de immuunregulatie is parasitaire EVs gebleken. De nieuwste studies in schistosomes beide Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 en S. japonicum12 hebben aangegeven dat volwassen schistosomes afscheiden exosome-achtige blaasjes die mogelijk deelnemen aan de functionele voorschriften van specifieke biologische processen.
Tot op heden, zijn verschillende methoden gebruikt om extracellulaire blaasjes, zoals ultracentrifugatie, ultrafiltratie13, het gebruik van polymeer gebaseerde reagentia, grootte-uitsluiting chromatografie en immunoaffinity isolatie isoleren. Deze verschillende methoden beschikken over hun eigen voordelen en beperkingen14. In het algemeen ultracentrifugatie wordt beschouwd als de gouden standaard methode om vesikel te isoleren. Deze methode is echter lijden van de beperking van mogelijke EV aggregatie14.
In schistosomes, een paar methoden zijn gemeld voor EV isolatie: deze omvatten ultracentrifugatie11,12,10 en het gebruik van commerciële EV isolatie kit16 voor verschillende stadia (eieren16, schistosomula11, volwassen schistosomes10,12,17). Gezien het feit dat microvesicles van een breed scala van grootte variërend van enkele honderden nanometer duizend nanometer, ontwikkelden we een alternatieve methode die met het gebruik van Bank centrifuge, ultrafiltratie en een commerciële EV isolatie kit combineert te isoleren van de EVs uit volwassen Schistosoma japonicum. De geïsoleerde EVs meestal bezat een diameter van 100-400 nm en met succes door de ontvangende cellen waren geïnternaliseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recente studies over EVs hebben aangetoond dat Schistosoma die EVS een belangrijke rol in9,12,16, gastheer-pathogeen interacties3,spelen. Naar verdere adres hun regelgevende taken, is het essentieel om te isoleren van EVs van schistosomes. Hier beschrijven we een alternatieve methode om SjEV te isoleren. Deze methode levert de omvang van een breed scala van SjEVs, van 100 nm tot 400 nm, in volw…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie was, gedeeltelijk of in zijn geheel, ondersteund door nationale Natural Science Foundation van China (31472187 en 31672550) en de landbouwkunde en het programma van de innovatie van de technologie van de Chinese Academie van landbouwwetenschappen.
Materials
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 | |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
