分離と大人住血吸虫から細胞外小胞のキャラクタリゼーション
Summary
ここでは、アダルト住血吸虫から培養体外細胞小胞 (Ev) の分離を記述するプロトコルを提案する.
Abstract
細胞小胞 (Ev) は、膜小胞の細胞外微小環境に様々 な細胞によって放出です。EVs は、異種の小胞の人口は 40 と 1,000 nm 間のサイズの範囲を表しています。蓄積された証拠は、EVs がホスト病原体の相互作用で重要な規制の役割を果たすことを示した。住血吸虫の EVs の深い理解は、住血吸虫ホスト相互作用、住血吸虫症に対する新しい戦略の開発を有効にするメカニズムに洞察力を提供しなければなりません。ここでは、さらにアダルト日本住血吸虫(S. ササユリ) から分離・同定 EVs のためのプロトコルを提示による住で EVs 機能を研究を目指しています。EVs は体外培養液遠心商業エキソソーム分離キットと組み合わせての使用から分離しました。分離されたs. ササユリEVs (SjEVs) は通常 100-400 nm の直径を持つし、透過電子顕微鏡と西部にしみが付くことによって特徴付けられます。PKH67 色素標識 SjEVs の使用は、SjEVs は受信者の細胞によって内面化を実証しています。全体として、我々 のプロトコルは大人住; から EVs を分離するための代替方法を提供します。分離 SjEVs の機能解析が適さない場合があります。
Introduction
細胞小胞 (Ev) は、様々 なタンパク質、脂質、核酸でカプセル化されます小さな膜結合型ベシクルの人口です。EVs が細胞間の情報伝達に重要な役割を果たして、細胞の分化、免疫調節、血管新生、セル移行2など多数の生理学的なプロセスの規則にかかわる最近の研究を実証 3,4,5。証拠の蓄積は、EVs を, 循環エクソソーム、および miRNA 貨物が特定疾患6の潜在的なバイオ マーカーを表すことを示します。
トリコモナス、 cruzi トリパノソーマの原因、リーシュ マニア属などのいくつかの原生動物、EVs; を分泌することができることが示されている。寄生虫が見つかってまた7をホストの生活に EVs を分泌します。寄生 EVs 感染、病原性8、および免疫調節9の維持に関与することが示されています。住での最近の調査は両方のマンソン住血吸虫(マンソン住血吸虫など) 10、11 S. ササユリ12アダルト住がありますエキソソームのような小胞を分泌することが示されています。特定の生物学的プロセスの機能の規則にかかわる。
日には、超遠心法、限外濾過法13イムノアフィニティーカラム分離、サイズ排除クロマトグラフィー, ポリマー ベースの試薬の使用など、細胞の小胞を分離するいくつかの方法を使用されています。これらの異なる方法では、独自の利点と制限14を所有しています。一般的に、遠心は小胞の分離のためのゴールド スタンダード メソッドと見なされます。ただし、このメソッドは、潜在的な EV 集計14の制限に苦しみます。
住、いくつかのメソッドは、EV の分離報告されている: 遠心11,12,10といくつかの段階 (卵16、商用 EV 分離キット16の利用が含まれますschistosomula11, アダルト住10,12,17)。ベンチの遠心分離機、限外濾過から EVs を分離するための市販 EV 分離キットの使用を組み合わせた代替法を開発した機構の解明は、1000 ナノメートル数百ナノメートルからのサイズの広い範囲が、アダルト日本住血吸虫。分離の EVs は、通常 100-400 nm の直径を所有し、正常に受信者の細胞によって内面化されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
Ev に関する最近の研究は、EVs は、宿主-病原体相互作用3,9,12,16で重要な役割を果たす、住血吸虫を実証しています。さらにアドレスに規制機能のそれは住から EVs を分離するため不可欠であります。ここでは、SjEV の分離のための代替方法をについて説明します。このメソッドは、100 から、SjEVs の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、一部または全部、国家自然科学基金、中国の (31472187 および 31672550) および農業科学と中国農業科学院の技術革新プログラムでサポートされています。
Materials
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 | |
References
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