Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o isolamento de vesículas extracelulares (EVs) em vitro culta médio de adultos Schistosoma japonicum.
Abstract
Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas membranosas lançadas por uma variedade de células no microambiente extracelular. SVE representa uma população de vesículas heterogêneas, cujo intervalo de tamanho entre 40 e 1.000 nm. Evidências acumuladas indicaram que EVs desempenham importantes funções reguladoras em interações patógeno-hospedeiro. Uma compreensão profunda da esquistossomíase EVs deve fornecer insights sobre os mecanismos subjacentes interações esquistossomíase-host, permitindo o desenvolvimento de novas estratégias contra a esquistossomose. Aqui, pretendemos estudar mais EVs funções em schistosomes apresentando um protocolo para o isolamento e caracterização de EVs de adultos Schistosoma japonicum (S. japonicum). SVE foram isolados em vitro o meio de cultura usando centrifugação combinada com um kit de isolamento exossomo comercial. Os isolados de S. japonicum EVs (SjEVs) normalmente possuem um diâmetro de 100-400 nm e são caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e mancha ocidental. O uso de PKH67 SjEVs de tingir-etiquetados demonstrou que SjEVs são internalizados pelas células destinatários. No geral, o nosso protocolo fornece um método alternativo para isolar EVs de schistosomes adultos; o SjEVs isolado pode ser adequado para análise funcional.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs) são uma população de pequenas vesículas de membrana-limite encapsulado com várias proteínas, lípidos e ácidos nucleicos. Estudos recentes demonstraram que EVs desempenham um papel crucial na comunicação célula-célula e estão envolvidos na regulação de numerosos processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento de célula, regulamento imune, angiogênese e da migração celular2, 3,4,5. Acumular evidências indica que EVs, circulando exosomes e sua carga de miRNA representa potenciais biomarcadores de determinadas doenças6.
Vários protozoários como Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzie Leishmania spp., foram mostrados para ser capaz de secretar EVs; Além disso foram encontrados helmintos de secretar EVs em vivo hospeda7. EVs parasitárias foram mostrados para ser envolvido na manutenção da infecção, patogenicidade8e imune regra9. Recentes estudos em schistosomes ambos Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 e S. japonicum12 têm indicado que adultos schistosomes secretam exossomo como vesículas que podem ser envolvidos na regulamentação funcional de processos biológicos específicos.
Até à data, vários métodos têm sido utilizados para isolar vesículas extracelulares, tais como ultracentrifugação, ultrafiltração13, o uso de reagentes baseado em polímero, cromatografia de exclusão-tamanho e isolamento de immunoaffinity. Esses métodos diferentes possuem suas próprias vantagens e limitações de14. Geralmente, a ultracentrifugação é considerada o método padrão-ouro para isolamento de vesículas. No entanto, este método sofre a limitação do potencial de agregação de EV14.
Em schistosomes, foram relatados alguns métodos para isolamento de EV: Estes incluem ultracentrifugação11,12,10 e o uso de comerciais EV isolamento kit16 para vários estágios (ovos16, schistosomula11, schistosomes adulto10,12,17). Dado que aumentada é de uma vasta gama de tamanho de várias centenas de nanômetros a mil nanômetros, desenvolvemos um método alternativo que combina com o uso de centrífuga de bancada e um kit de isolamento comercial EV para isolar o SVE de ultrafiltração adultos de Schistosoma japonicum. O SVE isolado normalmente possuía um diâmetro de 100-400 nm e com êxito foram internalizado pelas células destinatários.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudos recentes sobre EVs têm demonstrado que esquistossomíase que EVS desempenham um papel importante nas interações patógeno-hospedeiro3,9,12,de16. Para endereço ainda mais suas funções reguladoras, é essencial para isolar EVs de schistosomes. Aqui, descrevemos um método alternativo para SjEV isolamento. Este método produz um tamanho de ampla gama de SjEVs, de 100 nm a 400 nm, em …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi, em parte ou no todo, suporte Nacional Natural Science Foundation da China (31472187 e 31672550) e a ciência agrícola e programa de inovação de tecnologia da Academia Chinesa de Ciências agrárias.
Materials
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 | |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
