عزل وتوصيف حويصلات خارج الخلية من الكبار بالبلەارسيات بلهارسيه
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لوصف العزلة حويصلات خارج الخلية (EVs) المتوسط في المختبر ومثقف من الكبار بلهارسيه بالبلەارسيات.
Abstract
حويصلات خارج الخلية (EVs) هي الحويصلات الغشائية التي صدر عن مجموعة متنوعة من الخلايا إلى المكروية خارج الخلية. المركبات الكهربائية تمثل أن حويصلات غير المتجانسة، التي حجم يتراوح بين 40 و 000 1 نانومتر. وأشارت الأدلة المتراكمة إلى أن المركبات الكهربائية تلعب أدواراً تنظيمية هامة في التفاعلات المضيف الممرض. وينبغي التبصير على فهم عميق للمركبات الكهربائية المنشقات الآليات الأساسية للتفاعلات المنشقات-المضيف، مما يتيح وضع استراتيجيات جديدة ضد مرض البلهارسيا. هنا، ونحن نهدف إلى مواصلة دراسة وظائف المركبات الكهربائية في المنشقات بتقديم بروتوكول لعزل وتوصيف المركبات الكهربائية من الكبار بلهارسيه بالبلەارسيات (بالبلەارسيات S.). وكانت المركبات الكهربائية معزولة من المتوسطة الثقافة في المختبر باستخدام الطرد المركزي جنبا إلى جنب مع مجموعة مواد عزل اكسوسومي تجارية. معزولة بالبلەارسيات س. المركبات الكهربائية (سجيفس) عادة ما تمتلك يبلغ قطرها 100-400 نانومتر، وتتميز مجهر إلكتروني والنشاف الغربية. وأثبتت استخدام الصبغة المسماة سجيفس PKH67 أن سجيفس يتم استيعابه بالخلايا المتلقية. إجمالاً، لدينا بروتوكول يوفر طريقة بديلة لعزل المركبات الكهربائية من المنشقات الكبار؛ سجيفس معزولة قد تكون مناسبة للتحليل الوظيفي.
Introduction
حويصلات خارج الخلية (EVs) عدد سكان صغير الحويصلات الغشاء زمنياً مغلفة بمختلف البروتينات والدهون والأحماض النووية. الدراسات التي أجريت مؤخرا أظهرت أن المركبات الكهربائية تلعب دوراً حاسما في خلية خلية الاتصال، ويشاركون في تنظيم العديد من العمليات الفيزيولوجية، بما في ذلك التنمية الخلية والتنظيم المناعي والأوعية وخلية الهجرة2، 3،،من45. تتراكم الأدلة تشير إلى أن المركبات الكهربائية، تعميم اكسوسوميس، وحمولتها ميرنا تمثل المؤشرات الحيوية المحتملة لبعض الأمراض6.
البروتوزوا عدة مثل المشعرة المهبليةو مثقبيه الكروزية ليشمانيا spp.، أظهرت أن تكون قادرة على إفراز المركبات الكهربائية؛ بالإضافة إلى ذلك تم العثور على الديدان لإفراز المركبات الكهربائية في المعيشة وتستضيف7. أظهرت المركبات الكهربائية الطفيلية إلى المشاركة في الحفاظ على الإصابة والقدرة الإمراضية8التنظيم المناعي9. الدراسات الأخيرة في المنشقات كل 10، المنسونيه بلهارسيه (س. المنسونيه)11 و بالبلەارسيات س.12 قد أشارت إلى أن تفرز المنشقات الكبار حويصلات مثل اكسوسومي التي قد تكون وتشارك في اللوائح الفنية لعمليات بيولوجية معينة.
وحتى الآن، استخدمت عدة طرق لعزل حويصلات خارج الخلية، مثل تنبيذ فائق، أولترافيلتريشن13، واستخدام الكواشف المستندة إلى البوليمر، وحجم الاستبعاد اللوني والعزلة إيمونوافينيتي. هذه الأساليب المختلفة تمتلك14المزايا والقيود الخاصة بها. وبوجه عام، يعتبر تنبيذ فائق الأسلوب المعيار الذهبي لعزل حويصلة. ومع ذلك، يعاني هذا الأسلوب من الحد من التراكم EV المحتملة14.
في المنشقات، أبلغ عن اثنين من الأساليب لعزل EV: وتشمل هذه تنبيذ فائق11،،من1210 واستخدام التجاري EV العزلة طقم16 لعدة مراحل (16من البيض، شيستوسومولا11المنشقات البالغين10،،من1217). نظراً لأن ميكروفيسيكليس هم من طائفة واسعة من حجم نانومتر مئات عدة من آلاف نانومتر، قمنا بتطوير أسلوب بديل يجمع بين استخدام الطرد المركزي مقاعد البدلاء، أولترافيلتريشن، ومجموعة EV عزلة تجارية لعزل المركبات من بلهارسيه بالبلەارسياتمن الكبار. المركبات الكهربائية المعزولة عادة ما يمتلك يبلغ قطرها 100-400 نانومتر وتم استيعابه بنجاح بالخلايا المتلقية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أثبتت الدراسات الأخيرة على المركبات الكهربائية المنشقات تلك المركبات دوراً هاما في المضيف الممرض التفاعلات3،9،،من1216. مواصلة التصدي لمهامها التنظيمية، من الضروري عزل المركبات الكهربائية من المنشقات. هنا، يمكننا و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة كانت، جزئيا أو كلياً، تدعمها الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة الصين (31472187 و 31672550) والعلوم الزراعية والتكنولوجيا برنامج الابتكار من الأكاديمية الصينية للعلوم الزراعية.
Materials
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 | |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
