アンモニア繊維膨張(AFEX)リグノセルロース系バイオマスの前処理
Summary
アンモニア繊維膨張(AFEX)は、リグノセルロース系バイオマス(トウモロコシストーバー、稲わら、サトウキビバガスなど)を、バイオ燃料および動物飼料用途の消化性の高い原料に変換できる熱化学前処理技術です。ここではリグノセルロース系バイオマスに対するAFEX前処理を行うための実験室規模の方法について述べている。
Abstract
リグノセルロース材料は、植物由来の原料であり、作物残渣(例えば、トウモロコシのストーバー、稲わら、サトウキビバガ)や、バイオ燃料、生化学、動物飼料を大量に生産するために入手可能な目的で栽培されたエネルギー作物(例えば、ミスカンサス、スイッチグラス)です。植物多糖類(すなわち、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン)を細胞壁に埋め込み、有用な製品への変換に向けて非常に再計算します。アンモニア繊維膨張(AFEX)は、多糖類を発酵糖に加水分解するための酵素へのアクセス性を高める熱化学的前処理です。これらの放出された糖は、バイオリファイナリーの燃料および化学物質に変換することができる。ここでは、アンモニアリサイクルを行わずにグラムスケールで前処理されたバイオマスを製造するための実験室規模のバッチAFEXプロセスについて述べています。実験室規模のプロセスは、最適な前処理条件(例えば、アンモニアローディング、水負荷、バイオマスローディング、温度、圧力、滞留時間など)を特定するために使用することができ、詳細な物理化学的特性評価および酵素/微生物分析のための十分な量の前処理サンプルを生成します。実験室規模のAFEXプロセスを用いて前処理されたコーンストバーの酵素加水分解による発酵性糖の収率は、同様の前処理条件下でのパイロットスケールAFEXプロセスに匹敵する。本論文はリグノセルロース系バイオマスのAFEX前処理を行うための実験室規模の原子炉の安全で一貫した運転のための詳細な標準的な操作手順を提供することを目的としている。
Introduction
アンモニア繊維膨張(AFEX)は、揮発性アンモニアをセルロース系バイオマス前処理の主な反応物として使用する熱化学的前処理です。このプロセスは、もともと、糖質セルロース系バイオマスの再計算をコスト効率よく低減し、生物学的に触媒された前処理されたバイオマス分解を発酵糖11,22に増強するためにブルース・デールによって発明された。他のほとんどの水性熱化学前処理3とは異なり、AFEXは、バイオマス組成に大きな変化を引き起こさないドライからドライのプロセスであり、それに関連する廃棄物の生成と費用に伴う洗浄ステップを必要としません。パイロットスケールで過剰な揮発性アンモニアの回収が実証され、廃棄物発生や処理コストの削減が可能です。MBI(図1)が開発したパイロットスケールパックベッドAFEX原子炉システムは、蒸気ストリッピングを用いて残留アンモニアを回収し、高温の濃縮アンモニアを新しいパックベッド44,55に移す。AFEX前処理後、バイオマスに組み込まれた少量の窒素は、反芻動物および微生物によって非タンパク質窒素として使用できる。,10,11,さらに、様々な物理化学的メカニズム66、7、87,8を通してバイオマスの超構造を変えることで、AFEXはバイオマスの炭水化物活性酵素(CAZymes)へのアクセス性を高め、多糖加水分解率を数倍8,99に増加させ、また、それらの細胞分解性8微生物叢4011によって、その消化率を増加させる。4農家は長い間、低無水アンモニアローディング(<4%w/wベーシスの乾燥バイオマス)と周囲の圧力と温度10、11の存在下でプラスチックタープの下で数日または数週間バイオマスをインキュベートすることによって、反する人の消化率を高めるために、この方法のより簡単なバージョンを11採用してきました。
無水アンモニアは、1950年代に木材を解毒する可能性があり、1970年代初頭にパルプ薬として1970年代13、14、15、16、17、1814,15,16,17,で初めて調査されました。131980年代初頭、サブクリティカル条件下で加圧、高温、濃縮アンモニア(>30%NH4 OH)が、リグノセルロース系バイオマス19の酵素消化性および微生物発酵性を高めるためにデール研究所で最初に使用された。4このプロセスは、アンモニア凍結爆発、そしてアンモニア繊維爆発、そして最後にアンモニア繊維の膨張、または単にAFEXとして始まり、長年にわたっていくつかの名前の変更を受けました。同時期(1980年代半ば)頃、デュポン(現ダウデュポン)は、バイオマス,20、21、22,21の消化性を高めるために、超臨界およびほぼ臨界の無水アンモニアベースの前処理プロセスを使用して探求しました。22ここ数十年で、アンモニアリサイクル/パーコレーション23(ARP)、水性アンモニア(SAA)、またはアンモニアリサイクルなしのダウデュポンプロセスを含む前処理試薬として希釈水性アンモニア溶液を使用することに重点が置かれています。23いくつかの追加の方法は、無水アンモニア(低水分無水アンモニア(LMAA)、低液体アンモニア前処理25(LAA)の使用を見てきました25。 液体無水アンモニア26、27、27高液体から固体負荷へのアンモニア塩ベースの溶液28を利用した2つの26新しい高度な有機体ソルブ型前処理技術が、超低酵素負荷での前処理済みセルロース系の選択的リグニン分画と高効率酵素加水分解を可能にする開発が最近開発されました。最近のレビュー記事では、アンモニアベースの前処理の様々な形態の類似点と明確な違いを強調しています29.しかし、最近4年までは、アンモニアベースの前処理プロセス(AFEXなど)のパイロットスケールのデモンストレーションは、その過程で使用される濃縮アンモニアのクローズドループ化学リサイクルと効率的に結合されていませんでした。
本論文では、前処理されたバイオマスのグラムスケール(例えば、1〜数100g)を製造するために、実験室規模でセルロース系バイオマスを前処理するための最も一般的に使用されるAFEXプロトコルについて詳細に述べる。一般的に、バイオマスは水(0.1~2.0 gH2O/gの乾燥バイオマス)と混合され、カスタムメイドのステンレス製の管状またはパー型の原子炉に積み込まれます。次いで無水アンモニア(0.3~2.0 gNH3/g乾燥バイオマス)を反応器に加え、混合液を所望の反応温度(60~180°C)まで加熱します。1980年代から1990年代のAFEXプロセスに関する以前の出版物は、温度ランプの直後に前処理住居時間(例えば、5〜60分)を開始しました。しかし、アンモニアが反応器に添加されるとすぐに反応が起こるように、現在のAFEX手順は、アンモニア添加直後の滞留時間の監視を開始する。90°C以上の温度の場合、初期温度の上昇を最小期間(すなわち、<5分)に保つために、アンモニアをロードする前にバイオマスを予熱する必要がしばしばあります。滞留時間の完了時に、バルブを開いて圧力を迅速に放出し、ガス相内容物を適切な化学フュームフードにします。液体から気相へのアンモニアの急速な転換はまた、冷却する反応器を引き起こす。小さな原子炉(100 mL原子炉量)は冷却するために追加の時間が必要な場合があります。ユーザーの安全のために、より大きなスケール(原子炉実行当たり100gアンモニア)で、窒素でパージすることは、容器からできるだけ多くの残留アンモニアを除去し、荷降ろし前に原子炉の内容物を冷却するのを助けることをお勧めします。通常、アンモニアのリサイクルおよび/または回復をラボスケールで試みることはしません。AFEX前処理プロセスのスケールアップに関する設計上の重要な課題の1つは、最小限の資本コストと運用コストでアンモニアをリサイクルすることです。また、バイオマスに液体アンモニアを添加すると、一般にバイオマスを冷却する液体の部分的な点滅が促進され、AFEX処理を開始する前にバイオマス・アンモニア混合物の加熱が必要となります。アンモニアを液体として添加するのではなく、バイオマスにアンモニア蒸気を加えることは2つの利点を提供する:まず、バルクバイオマスの高い空隙率はアンモニア蒸気を急速に輸送することができ、バイオマス全体にアンモニア分布さえも生じる。第2に、アンモニア蒸気は、湿ったバイオマスに浸潤した水に容易に、そして発熱して、バイオマスを急速かつ均一に加熱する発熱を生じさせる。これらの利点を活用するために、MSU DaleラボとMBIの両方がアンモニア蒸気を用いたAFEX処理方法を開発しました。デール研究室では、ガス状アンモニア前処理(GAP)プロセス30を開発し、MBIはパイロットスケールで実証されたパックベッドAFEX原子炉プロセス(図1)4を開発しました。4パックベッドAFEXの原子炉システムは蒸気のストリッピング方法44、55を使用してアンモニアの完全なリサイクルと半バッチモード動作が可能である。この新しいMBIパイロットスケールプロセスは、アンモニアの化学的および物理的特性を利用して、アンモニアを効率的にリサイクルしながらバイオマスを効率的に退避させます。
ここでは、カスタム構築された200 mL体積管状原子炉を使用して、ラボスケールでコーンストーバーのAFEX前処理を行うための詳細な概要を提示します(図2)。AFEX前処理サンプルを、市販のセルロ分解酵素カクテルを使用して発酵糖に消化し、前処理プロセスの有効性を実証した。実験室規模のAFEX反応器の酵素加水分解結果を、より大きなパイロットスケールのAFEX反応器生成サンプルと比較した。私たちの目標は、トウモロコシストーバーのようなセルロース系バイオマスに対してAFEX前処理を行うためのラボスケール加圧反応器の安全で一貫した動作のための標準的な操作手順を提供することです。このラボスケールのAFEX前処理プロセス(例えば、パイロットスケールパックベッドAFEXプロセス)のバリエーションに関する追加のサポート情報は、付属の補足pdfファイルでさらに強調されています。パックベッドAFEXプロセスの運用手順に関する詳細なレポートは、別の出版物で強調表示され、MBI-MSUからの要求に応じて利用可能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
AFEXプロトコルは、無水アンモニアと高温での水の存在下で植物材料を処理し、セルロ分解酵素および/または微生物による前処理材料の消化性を高める方法を記述しています。AFEXは、これらの材料31に自然に豊富に存在するエステルリンケージを切断するプロセスの効率のために、グラミノイドモノコット種(例えば、コーンストーバー、スイッチグラス、ミスカンサス、稲わら、麦わら、サトウキビバガス)に対して非常に有効である。AFEXは、リグニンと炭水化物ベースのエステル結合の割合が小さいため、二コットや体育者(広葉樹、軟樹、天然のforbs)32、33に由来するバイオマスにはあまり効果がありません。32,しかし、植物バイオテクノロジーを用いてこれらのリンケージが木質細胞壁に導入されると、AFEX前処理プロセスははるかに効果的になる34.
エステル結合の切断は、ある種のバイオマス成分を材料から除去することを可能にするが、外細胞壁表面に抽出物として再堆積し、セルロ分解酵素6の浸透および作用を促進するナノスケールの穴の形成をもたらす。AFEX前処理コーンストーバーは、未処理の材料と比較して高固形分条件下で酵素加水分解後のグルコースおよびキシロース放出率の約3倍の増加を示した。アンモニア前処理はまた、希酸前処理35と比較して、より少なく、はるかに少ない阻害分解生成物を生成する。AFEXと希酸処理コーンストーバーの以前の比較では、希酸前処理は、316%以上の酸、142%以上の芳香族、および35,3,555%以上のフランアルデヒドを生成36することを示した。また、AFEXはドライツードライプロセスであるため、酵素加水分解の際に経済的に利用できない希薄液流として糖の損失もありません。しかし、これは、酵素加水分解中に細胞壁多糖をグルコースやキシロースなどの混合発酵糖に完全に分解するために、セルロース分解およびヘミセルロース分解能力の両方を有する酵素として合併症を引き起こす。ヘミセルロースオリゴマーはセルラーゼ活性38を阻害すると報告されており、高い最終糖収率を維持するためにより高い酵素負荷を必要とする可能性がある。しかし、適切な酵素カクテルの最適化は、AFEX,前処理バイオマス,,,39、40、41、42、43、44、45の糖化中の全体的な酵素使用量44を45減らすことができます。39,40414243AFEX前処理プロセス中にエステル結合の加水分解およびアンモノ分解は、前処理されたバイオマス中の酸およびアミド生成物(例えば、酢酸/アセトアミド、フェルル酸/フェルラミド、クマリン酸/クサリアミド)36に至る。アミドの形成は発酵プロセスを助けるために示されているが、前処理された原料中の非常に高い濃度での存在は、動物に前処理されたビオマを供給する場合に懸念される可能性がある。AFEX前処理の前にNaOHまたはCa(OH)2などのアルカリとのエステルリンケージの2 前加水分解は、問題に対処するために使用することができます。
AFEX プロセス中に無水アンモニアを使用する場合は、多くの安全性に注意してください。無水アンモニアは、銅、真鍮、アルミニウム、炭素鋼、およびシールに使用される一般的なフルオロエラストマーポリマー(例えばビトンなど)と反応する。アンモニアに接触するチューブまたは反応器コンポーネントはステンレス鋼製で、ガスケット、バルブシート、クイックコネクトシールは可能な場合はテフロンまたはカレズ製の必要があります。アンモニアは有毒な化学物質とは見なされませんが、吸湿性と極低温特性のために依然として危険です。それは容易に標的と目および呼吸器系の粘膜に深刻な損傷を与える。アンモニアは極低温液であり、アンモニア漏れはガス流または冷蔵機器との直接接触のために重度の凍傷を引き起こす可能性があります。アンモニアは、300ppmを超える濃度で生命と健康(IDLH)に直ちに危険です。集中力が50ppmを超えた場合は、直ちに避難する必要があります。オペレータは、その近くの危険な濃度を警告するために校正されたアンモニアモニターを着用することをお勧めします。メインの作業領域にアラーム付きセンサーを設置することもお勧めします。アンモニアを扱う作業員は、メチルアミンカートリッジを装着した脱出呼吸器、極低温および熱保護手袋などの保護具を適切に訓練し、緊急事態に対処する準備をする必要があります。無水アンモニアにさらされた場合、オペレータは安全に移動し、少なくとも15分間、患部を水で直ちに洗い流す必要があります。アンモニア前処理プロセスは、フュームフードの内部で行われるべきであり、アンモニアシリンダーは、ヒュームフードまたは換気キャビネットに格納する必要があります。実験の後、前処理されたバイオマスは残留性アンモニアを有し、夜間にフード内で乾燥するか、またはフォローアップ実験のために室温でビニール袋に保管する前にカスタム換気乾燥ボックスで乾燥させるべきである。他のいくつかの重要な安全上の考慮事項には、アンモニアを原子炉に正確に送達するのに役立つアンモニア送達システムと、前処理プロセスが受ける圧力の少なくとも1.5倍を処理するように設計された原子炉を設置することが含まれます(例えば、2 x 106 Pa圧力でAFEXプロセスを処理する場合、原子炉の最低圧力定格は3 x 106 Paでなければなりません)。
AFEX前処理は、動物飼料として、または燃料や化学物質を生成するための飼料として直接使用することができる高度に消化性の高い植物バイオマスを生成するための有望な方法です。これら2つの産業を超えて、AFEXはバイオマテリアルを製造するためのバイオ再生可能原料やバイオガスを生産するための原料として使用される可能性があります。実験室規模のプロセスは、適切な換気スペースと安全対策を備えた実験室で行うことができる、と我々の現在の研究は、このスケールダウンAFEXプロセスは、スケールアップおよび/またはパイロットAFEX反応器で生成された材料と同様の結果を示すことを確認します。ラボスケールのAFEXプロセスを使用すると、高スループット方式で原料、加工条件、アプリケーションをテストできる一方で、パイロットスケールや工業用スケールでのプロセスの実行方法を合理的に期待できます。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この資料は、五大湖バイオエネルギー研究センター、米国エネルギー省、科学局、生物環境研究局が賞番号DE-S0018409およびDE-FC02-07ER64494の下で支援した研究に基づいています。レベッカ・オンは、ミシガン工科大学からの部分的な支援(スタートアップ資金)を認めています。シシル・チュンダワトは、米国国立科学財団CBET賞(1604421)、ORAUラルフE.パウ賞、ラトガース工科大学(スタートアップ資金)からの部分的な支援を認めています。ブルース・デールは、ミシガン州立大学AgBioResearch事務所とUSDA国立食糧農業研究所からの部分的な支援を認めています。ヴェンカテシュ・バランは、テキサス州とヒューストン大学(スタートアップ・ファンディング)からの部分的な支援を認めています。MBIの従業員は、米国エネルギー省とミシガン州立大学財団からの部分的な支援を認めています。最後に、この論文をメンター兼共著者のブルース・デール教授に捧げ、持続可能なセルロースバイオ燃料を作るという私たちの夢を共同で追求するよう促したいと思います。
Materials
| Safety Equipment/PPE | |||
| Ammonia Monitor | CanarySense | BW GAXT-A-DL | Single gas detector, Ammonia (NH3), 0 to 100 ppm |
| Cryogenic gloves | Amazon | B01L8WA238/B01L8WA1H0/B01L8WA1O8 | Keep hands protected when handling liquid ammonia |
| Ear muffs | 3M | H7A | Ear muffs to protect hearing when releasing ammonia at end of pretreatment |
| Face shield | – | – | Wear while handling ammonia |
| Heat protective gloves | Grainger | 2EWX1/2EWX2/2EWX3 | Showa heat resistant gloves, max temperature 500°F |
| Nitrile gloves | – | – | Wear while mixing biomass to prevent contamination |
| Reagents | |||
| Anhydrous Ammonia Compressed Gas Cylinder | – | – | An anhydrous ammonia compressed gas cylinder with a dip tube is required for this process. The dip tube is essential in order to withdraw liquid ammonia from the cylinder. |
| Distilled water | – | – | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
| Milled or Chopped Corn Stover | – | – | Corn stover is not readily commercially available. Contact local farmers or agricultural extension if you wish to locate some. |
| Nitrogen Compressed Gas Cylinder | – | – | |
| Equipment | |||
| Ammonia Cylinder Adapter | – | – | CGA fitting that depends on the gas cylinder. Matheson is a good source. Some require teflon gaskets. This connects the cylinder to the ammonia delivery system. A regulator is not necessary as the system uses liquid ammonia. |
| Ammonia Delivery System (Figure 4) | Swagelok | Misc. | Stainless steel pressure cylinder and components, valves, check valves, and gauges were used for all lines potentially in contact with ammonia. |
| Analytical Balance | Sartorius | CPA4202S | Balance used for preparing biomass and weighing the reactors. Toploading balance, 4200g x 0.01g |
| Chemraz O-rings | Harvard Apparatus | 5013091 | Ammonia-resistant o-rings for the SS syringe |
| Custom Tubular Reactors (Figure 3) | Parts were purchased from McMaster-Carr, Swagelok, Omega, and Motion Industries (Dixon Fittings) | Misc. | To be compatible with ammonia, the custom reactor was constructed from stainless steel components (sanitary tube and fittings, compression fittings, quick connect, pressure gauge, thermocouple), and teflon gaskets. The maximum pressure rating of the vessel is 1500 psig, which is the maximum pressure rating of the bolted sanitary clamps. |
| Drying Box | – | – | Optional: an enclosed system for drying is necessary if planning to do microbial experiments to avoid contamination. Avoid drying at elevated temperatures. |
| High Pressure Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3311 | Infuse/Withrdraw PHD ULTRA HPSI Programmable Syringe Pump for transferring liquid ammonia |
| Moisture Analyzer | Sartorius | MA35 | Moisture analyzer for determining moisture content of biomass prior to pretreatment. |
| Nitrogen Delivery | Misc. | Misc. | Nitrogen compressed gas cylinder, inert gas regulator (at least 1000 psig max pressure rating), lines, and valves. |
| Ratchet wrench and 7/8" socket | – | – | Ratchet and socket to quickly tighten and open bolts on the sanitary clamp. Can be purchased anywhere. |
| Retractable Thermocouple Cables | Omega | RSC-K-3-4-5 | Retractable thermocouple cable. You need one for each reactor. |
| Stainless Steel Syringe | Harvard Apparatus | 702261 | Stainless steel syringe for tranferring ammonia to the reactors. |
| Temperature Monitor | Omega | HH12B | Dual input temperature monitor. You need one for every two reactors. |
| Voltage Controller | McMaster-Carr | 6994K11 | Variable-Voltage Transformer for controlling heating to the reactors. You need one for each reactor. |
| Supplies | |||
| Metal Scoops, Spoons and/or Spatulas | – | – | For transferring biomass for weighing, mixing, transferring into the reactor and removing from the reactor at the end of the run |
| Plastic Bowls or Tubs | – | – | Used for mixing the biomass with the water. Any bowl or tub could be used. |
| Spray Bottle | – | – | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
| Wide-Mouth Funnel | – | – | Any funnel that has a bottom opening 0.5-1.0 inches diameter. |
| Wooden Dowel | – | – | 1-1.5" diameter wooden dowel to assist with loading/unloading the reactor |
| Consumables | |||
| Glass Wool | Sigma-Aldrich | CLS3950-454G | For packing the top of the reactor to prevent biomass escape and clogging the tubing |
| Plastic Press-to-Close Bags | McMaster-Carr | 1959T24 | Bags for storing processed samples and for transferring to drying box |
| Plastic Tote | – | – | Used to transfer pretreated biomass to an alternate location for drying |
| Plastic Weighboats or Metal Trays | – | – | Used to catch the biomass when removing from the reactors, and for storing the samples while drying |
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