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Environment

Prétraitement de la biomasse lignocellulosique de fibres d’ammoniac (AFEX)

Published: April 18, 2020
doi:
10.3791/57488
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1Department of Chemical and Biochemical Engineering,Rutgers-State University of New Jersey, 2Michigan Biotechnology Institute (MBI), 3Department of Chemical Engineering and Materials Science,Michigan State University, 4Engineering Technology Department, Biotechnology Program, College of Technology,University of Houston, 5Department of Chemical Engineering,Michigan Technological University

Summary

L’expansion de la fibre d’ammoniaque (AFEX) est une technologie thermochimique de prétraitement qui peut convertir la biomasse lignocellulosique (p. ex. stover de maïs, paille de riz et bagasse de canne à sucre) en une matière première très digestible pour les biocarburants et les applications d’alimentation animale. Ici, nous décrivons une méthode à l’échelle de laboratoire pour effectuer le prétraitement AFEX sur la biomasse lignocellulosique.

Abstract

Les matériaux lignocellulosiques sont des matières premières d’origine végétale, comme les résidus de culture (p. ex., la râle du maïs, la paille de riz et la bagasse de canne à sucre) et les cultures énergétiques cultivées à cet effet (p. ex., le miscanthus et l’herbe à aiguillage) qui sont disponibles en grande quantité pour produire des biocarburants, des produits biochimiques et des aliments pour animaux. Les polysaccharides végétaux (c.-à-d. cellulose, hemicellulose et pectine) incorporés dans les parois cellulaires sont fortement récalcitrants vers la conversion en produits utiles. L’expansion de la fibre d’ammoniaque (AFEX) est un prétraitement thermochimique qui augmente l’accessibilité des polysaccharides aux enzymes pour l’hydrolyse dans les sucres fermentables. Ces sucres libérés peuvent être convertis en combustibles et en produits chimiques dans une bioraffinerie. Ici, nous décrivons un processus AFEX à l’échelle de laboratoire pour produire de la biomasse prétraité à l’échelle du gramme sans aucun recyclage d’ammoniac. Le processus à l’échelle du laboratoire peut être utilisé pour identifier les conditions optimales de prétraitement (p. ex., chargement d’ammoniac, chargement de l’eau, chargement de la biomasse, température, pression, temps de résidence, etc.) et génère des quantités suffisantes d’échantillons prétraités pour une caractérisation physicochimique détaillée et une analyse enzymatique/microbienne. Le rendement des sucres fermentables provenant de l’hydrolyse enzymatique du recoin du maïs prétraité à l’aide du processus AFEX à l’échelle de laboratoire est comparable au processus AFEX à l’échelle pilote dans des conditions de prétraitement similaires. Ce document vise à fournir une procédure d’exploitation standard détaillée pour l’exploitation sûre et cohérente des réacteurs à l’échelle de laboratoire pour effectuer le prétraitement AFEX de la biomasse lignocellulosique.

Introduction

L’expansion de la fibre d’ammoniaque (AFEX) est un prétraitement thermochimique qui utilise l’ammoniac volatil comme principal réactif pour le prétraitement de biomasse cellulosique. Ce processus a été inventé à l’origine par Bruce Dale pour réduire de façon rentable la récalcitrance de la biomasse lignocellulosique et améliorer la déconstruction de la biomasse prétrative biologiquement catalysée en sucres fermentables1,2. Contrairement à la plupart des autres prétraitements thermochimiques à base aqueuse3, AFEX est un processus sec à sec qui ne provoque aucun changement significatif dans la composition de la biomasse et ne nécessite aucune étape de lavage avec sa production et ses dépenses de déchets associées. Le rétablissement de l’ammoniac volatil excédentaire a été démontré à l’échelle pilote, ce qui a réduit les coûts de production et de traitement des déchets. Le système de réacteur AFEX à l’échelle du pilote développé par MBI (figure 1) récupère l’ammoniac résiduel à l’aide du décapage de vapeur et transfère l’ammoniac chaud et concentré à un nouveau lit emballé4,,5. Après le prétraitement AFEX, les quantités mineures d’azote incorporées dans la biomasse sont utilisables comme azote non protéiné par les animaux ruminants et les micro-organismes. En outre, en modifiant l’ultrastructure de biomasse par divers mécanismes physicochimiques6,7,8, AFEX augmente l’accessibilité de la biomasse aux enzymes inaliénables (CAZymes) et augmente les taux d’hydrolyse polysaccharides de plusieurs fois8,9, ce qui augmente également sa digestibilité par les animaux ruminants via leur microbiome cellulolytique4,10,11,112. Les agriculteurs ont longtemps utilisé une version plus simple de cette méthode pour augmenter la digestibilité des fourrages ruminants en incuber la biomasse pendant des jours ou des semaines sous des bâches en plastique en présence de faibles charges d’ammoniac anhydre (-lt;4% w / w base de la biomasse sèche) et les pressions ambiantes et les températures10,11.

L’ammoniac anhydre a été étudié pour la première fois pour son potentiel à délire le bois dans les années 1950 et comme produit chimique de la pâte au début des années 197013,14,15,16,17,18. Au début des années 1980, l’ammoniac concentré sous pression, à haute température (30 % NH4OH) dans des conditions sous-critiques a été utilisé pour la première fois dans le laboratoire Dale pour améliorer la digestibilité enzymatique et la fermentabilité microbienne de la biomasse lignocellulosique19. Ce processus a subi plusieurs changements de nom au fil des ans, en commençant par l’explosion de gel d’ammoniac, puis l’explosion de fibre d’ammoniac, et enfin, l’expansion de la fibre d’ammoniac, ou tout simplement AFEX. À peu près à la même époque (mi-fin des années 1980), DuPont (aujourd’hui Dow-DuPont) a également exploré l’utilisation de processus de prétraitement à base d’ammoniac anhydrique supercritiques et quasi critiques pour augmenter la digestibilité de la biomasse20,21,22. Au cours des dernières décennies, l’accent a été mis de plus en plus sur l’utilisation de solutions d’ammoniac aqueux dilués comme réactif de prétraitement, y compris le recyclage de l’ammoniac /percolation23 (ARP), le trempage dans l’ammoniac aqueux (SAA), ou le processus Dow-DuPont sans ammoniacrecycler 24. Quelques méthodes supplémentaires ont examiné l’utilisation de l’ammoniac anhydre (ammoniac anhydre à faible humidité (LMAA) et le prétraitement à l’ammoniac à faible teneur en liquide25 (LAA). deux nouvelles technologies avancées de prétraitement de type organosolvique utilisant l’ammoniac anhydre liquide26,27 et les solutions à base de sel d’ammoniac28 à des charges liquides élevées aux charges solides ont été récemment développées qui permettent la fractionnement sélectif de la lignine et l’hydrolyse enzymatique à haut rendement de la biomasse cellulosique pré traitée à des chargements enzymatiques ultra-faibles. Un article de revue récent a mis en évidence les similitudes et les différences distinctes entre diverses formes de prétraitements à base d’ammoniac29. Cependant, jusqu’à récemment4, il n’y avait pas de démonstrations à l’échelle pilote de processus de prétraitement à base d’ammoniac (comme AFEX) qui ont été efficacement couplés avec le recyclage chimique en boucle fermée de l’ammoniac concentré utilisé dans le processus.

Dans cet article, nous décrivons en détail le protocole AFEX le plus couramment utilisé pour prétreter la biomasse cellulosique à l’échelle de laboratoire pour produire des échelles de gram de biomasse prétraité (p. ex., 1 à plusieurs 100 g). En règle générale, la biomasse est mélangée à de l’eau (0,1 à 2,0 g H2O/g de biomasse sèche) et chargée dans un réacteur tubulaire en acier inoxydable ou parr sur mesure. L’ammoniac anhydre est ensuite ajouté (0,3 à 2,0 g de biomasse sèche NH3/g)au réacteur et le mélange est chauffé à la température de réaction souhaitée (60 à 180 oC). Des publications antérieures sur le processus AFEX des années 1980-1990 ont commencé le temps de résidence de prétraitement (p. ex., 5-60 min) immédiatement après la rampe de température. Cependant, comme les réactions se produisent dès que l’ammoniac est ajouté au réacteur, la procédure actuelle AFEX est de commencer à surveiller le temps de résidence immédiatement après l’ajout d’ammoniac au réacteur. Pour des températures de 90 oC ou plus, il est souvent nécessaire de préchauffer la biomasse avant de charger l’ammoniac afin de maintenir la température initiale à une période minimale (c.-à-d., lt;5 min). À la fin du temps de résidence, une soupape est ouverte pour relâcher rapidement la pression, et le contenu de phase gazeuse dans un capot de fumée chimique approprié. La conversion rapide de l’ammoniac du liquide à la phase de gaz provoque également le refroidissement du réacteur. Les petits réacteurs (volume du réacteur de 100 ml) peuvent souvent être déchargés immédiatement dans le capot de fumée, tandis que les réacteurs plus gros (volume du réacteur de 100 ml) peuvent avoir besoin de plus de temps pour refroidir. Pour la sécurité des utilisateurs, à plus grande échelle (100 g d’ammoniac par réacteur), il est recommandé de purger avec de l’azote pour enlever autant d’ammoniac résiduel que possible du navire et aider à refroidir le contenu du réacteur avant de décharger. En règle générale, aucune tentative n’est faite à l’échelle du laboratoire pour recycler et/ou récupérer l’ammoniac. L’un des principaux défis de conception pour l’intensification du processus de prétraitement AFEX a été le recyclage de l’ammoniac avec un minimum de capital et de coûts d’exploitation. En outre, l’ajout d’ammoniac liquide à la biomasse entraîne généralement un clignotement partiel du liquide qui refroidit la biomasse, nécessitant le chauffage du mélange biomasse-ammoniac avant le début du traitement AFEX. Plutôt que d’ajouter de l’ammoniac comme liquide, l’ajout de vapeur d’ammoniac à la biomasse offre deux avantages : premièrement, la porosité élevée de la biomasse en vrac permet de transporter rapidement la vapeur d’ammoniac, ce qui entraîne même une distribution d’ammoniac dans toute la biomasse. Deuxièmement, la vapeur d’ammoniac se dissout facilement et exothermiquement dans l’eau entraînée dans la biomasse humide, ce qui entraîne une production de chaleur qui chauffe rapidement et uniformément la biomasse. Pour exploiter ces avantages, le laboratoire MSU Dale et MBI ont développé des méthodes de traitement AFEX à l’aide de vapeur d’ammoniac. Le laboratoire Dale a mis au point le procédé gaseous Ammonia Pretreatment (GAP)30, et MBI a mis au point le procédé du réacteur AFEX(figure 1)4, qui a été démontré à l’échelle pilote. Le système de réacteur AFEX lit emballé est capable de fonctionnement en mode semi-batch avec le recyclage complet de l’ammoniac en utilisant une méthode de décapage à vapeur4,5. Ce nouveau procédé à l’échelle pilote MBI exploite les caractéristiques chimiques et physiques de l’ammoniac pour prétrer efficacement la biomasse tout en recyclant efficacement l’ammoniac.

Ici, nous présentons un aperçu détaillé pour effectuer le prétraitement AFEX de la cornomie à l’échelle du laboratoire à l’aide de réacteurs tubulaires à volume personnalisé de 200 mL(figure 2). Les échantillons prétraités AFEX ont été digérés aux sucres fermentables utilisant des cocktails enzymatiques cellulolytiques disponibles dans le commerce pour démontrer l’efficacité des processus de prétraitement. Les résultats d’hydrolyse enzymatique pour le réacteur AFEX à l’échelle de laboratoire ont été comparés à des échantillons de réacteur AFEX à l’échelle pilote plus importants. Notre objectif est de fournir une procédure d’exploitation standard pour le fonctionnement sûr et cohérent des réacteurs pressurisés à l’échelle de laboratoire pour effectuer le prétraitement AFEX sur la biomasse cellulosique comme le recoulage du maïs. D’autres renseignements à l’appui concernant les variations de ce processus de prétraitement AFEX à l’échelle de laboratoire (p. ex., le processus AFEX à l’échelle du pilote) sont également mis en évidence dans le fichier pdf supplémentaire qui l’accompagne. Un rapport détaillé sur les étapes opérationnelles du processus AFEX de lit emballés sera mis en évidence dans une publication distincte et sera disponible sur demande de MBI-MSU.

Protocol

1. Ajustement de la teneur en humidité de la biomasse Voir la Table des Matériaux décrivant tous les équipements et matériaux majeurs nécessaires pour effectuer le prétraitement AFEX à l’échelle de laboratoire à l’aide du réacteur TUBulaire AFEX sur mesure(figure 2). Déterminer la teneur totale en humidité de la biomasse à l’aide d’un analyseur d’humidité, ou d’un four réglé à 105 oC pendant 8 h. Pour la méthode du four, transférer les échantillons à un desiccateur résistant à la chaleur pour refroidir pour empêcher l’adsorption d’eau avant le séchage. Effectuez le processus en double ou en triplicate et calculez la teneur moyenne en humidité. Pour une charge de biomasse sèche donnée dans le réacteur (ici, elle contient 25 g), utilisez la teneur en humidité déterminée à l’étape 1.2, pour calculer la quantité de biomasse humide qui doit être chargée.[1]Où mhumide – masse totale de biomasse (base de poids humide); msec – masse de biomasse sur une base de poids sec; MCTWB – teneur en humidité de la biomasse sur une base de poids total Peser cette quantité de biomasse (mhumide)dans un récipient en plastique. Calculez la quantité d’eau à mélanger à la biomasse humide pour atteindre la teneur en humidité désirée. Pour le maïs, il s’agit généralement de 0,6 g de H2O par g de biomasse sèche.[2]Oùm eau et masse d’eau ajoutées au réacteur (en plus de l’eau dans la biomasse); xeau – Chargement d’eau AFEX (g: biomasse sèche) À l’aide d’une bouteille de pulvérisation, ajouter lentement cette quantité d’eau (md’eau)à la biomasse qui avait été précédemment pesée et bien mélanger à la main. 2. Charger et assembler le réacteur Assembler le corps du réacteur en plaçant un bouchon et un joint de téflon au fond du tube du réacteur. Boulonner une pince en place, serrant les deux noix uniformément à l’aide d’une rachet. Transférer la biomasse humide à la base du réacteur assemblé et placer un bouchon de laine de verre au sommet de la biomasse. Déposer un joint de téflon sur le dessus du réacteur. Assurez-vous que la région est exempte de biomasse et de laine de verre, ce qui pourrait empêcher un joint efficace, et placer la tête du réacteur sur le dessus, manœuvrant le thermocouple à travers la laine de verre et la biomasse. Boulonnez la pince vers le haut du réacteur à l’aide d’un cliquet uniformément des deux côtés. Peser le réacteur(réacteurm ) et enregistrer le poids. 3. Configurer le système du réacteur et remplir le cylindre de transfert d’ammoniac Confirmez que tout l’équipement est branché et opérable (contrôleur de température, moniteur de température, pompe à seringue, minuteries). Réglez les minuteries au temps de résidence souhaité pour que chaque réacteur et échantillon soit exécuté. Allumez et, si vous utilisez une pompe à seringue programmable, configurez la méthode de livraison d’ammoniac sur la pompe à seringue.Étape 1 : Retrait.Étape 2 : Attendez 15 secondes (pour laisser le temps d’ouvrir et de fermer les vannes).Étape 3 : Infuser (pour transférer l’ammoniac dans le réacteur). Enregistrer comme méthode AFEX pour permettre une réutilisation facile. Vérifiez que toutes les vannes dans et hors du petit cylindre d’ammoniac sont fermées. Si le cylindre a été utilisé précédemment et contient de l’ammoniac résiduel / azote, lentement ouvrir la valve A sur le dessus du petit cylindre d’ammoniac pour saigner tout azote et fermer la valve une fois que l’ammoniac liquide commence à jaillir. Pour remplir le petit cylindre d’ammoniac, ouvrez le grand cylindre d’ammoniac anhydre et toutes les vannes sur la ligne d’ammoniac. Ouvrir lentement la soupape (B) près du sommet du petit cylindre d’ammoniac jusqu’à ce que la pression se stabilise. Attendez 5 minutes avant de passer à l’étape suivante. Environ 120 ml d’ammoniac sont chargés du cylindre principal au cylindre de transfert pendant cette période. Fermez toutes les vannes entre le réservoir d’ammoniac et le petit cylindre d’ammoniac, en travaillant de gauche à droite, en commençant par le petit cylindre (valve B) et en terminant à la soupape principale sur le dessus du réservoir. Réglez le régulateur de l’azote à 350 psi. Ouvrez la vanne sur le cylindre d’azote et la soupape sur le régulateur attaché. Ouvrez la soupape C sur le petit cylindre d’ammoniac pour ajouter lentement de l’azote, surpressurant le système. Ajustez la pression du petit cylindre à 350 psi, au besoin, en ajustant le point de réglage sur le régulateur. Gardez les lignes d’azote ouvertes tout en distribuant de l’ammoniac. 4. Préchauffer le réacteur (pour les températures de réaction de 100 ‘C) Branchez le moniteur de température sur le thermocouple et le ruban chauffant au contrôleur de température. Ajuster manuellement le contrôleur de température pour amener le réacteur à 60 oC. 5. Chargez le réacteur avec de l’ammoniac Allumez la pompe à seringue si elle n’est pas déjà allumée. Calculer le volume d’ammoniac requis en fonction de la charge d’ammoniac souhaitée (g: g de biomasse sèche) et d’un étalonnage d’ammoniac précédemment déterminé.[3]REMARQUE : Parce que la pompe d’ammoniac se charge sur une base de volume, lors de son première utilisation, étalonner pour convertir de la masse requise en volume. Suivez la même procédure utilisée pour AFEX, mais terminez la course (vent le réacteur) immédiatement après le chargement de l’ammoniac et le pesage du réacteur. Suivez la même procédure pour décharger le réacteur. Configurez la méthode pour charger la bonne quantité d’ammoniac : Sélectionnez la méthode AFEX à partir de la section 3.3. Définition de l’étape de la presse (fr) Étape: 1 Définir le volume ou le temps cible. Clé dans le volume requis dans mL à l’aide du bloc-notes et appuyez sur la marque de contrôle verte. Si plus de 85 ml sont nécessaires, entrez le volume cible comme la moitié de la quantité spécifiée dans la feuille de calcul et remplissez le réacteur deux fois en utilisant le même volume de seringues. Répétez les étapes 5.3.2 à 5.3.4 pour “Step: 3”. Appuyez sur le bouton arrière. Ouvrez la soupape (D) au fond du petit cylindre d’ammoniac vers l’échappement, puis fermez-la une fois que l’ammoniac résiduel est sorti. Ouvrez la soupape (E) à l’extrémité de la pompe à seringue vers l’avant du capot de fumée, puis ouvrez la soupape (F) pour libérer tout ammoniac résiduel. Fermer les vannes (E) et (F). Déconnectez le réacteur du moniteur de température et du contrôleur de température. Attachez le réacteur à la connexion rapide. Ouvrez la soupape (D) vers le petit cylindre d’ammoniac et la soupape ouverte (E) vers le petit cylindre d’ammoniac. Appuyez sur la flèche verte sur la pompe pour démarrer la séquence et dessiner de l’ammoniac dans la seringue. Lorsque la seringue s’arrête automatiquement pendant la période d’attente, tournez la soupape de seringue (E) vers le réacteur, et la soupape d’entrée du réacteur de sorte qu’elle pointe vers la tige de raccordement rapide.Après le retard, la seringue commencera à infuser, s’arrêtant automatiquement au point de réglage. Si plus de 85 ml d’ammoniac sont nécessaires, répétez les étapes 5.7 à 5.9. Fermer la vanne et la soupape du réacteur (D). Ouvrez la soupape (F) pour libérer l’ammoniac résiduel de la seringue, puis fermez la soupape (F) et fermez la soupape (E). Ouvrez la soupape (D) vers l’échappement, puis fermez-la une fois que l’ammoniac résiduel est parti. Portant des gants cryogéniques, retirez le réacteur de la connexion rapide. Faites attention au spray potentiel d’ammoniac. Utilisez la ligne d’évent du tronc d’éléphant pour évacuer l’ammoniac libéré, si nécessaire. Démarrer la minuterie pour le réacteur approprié. Peser l’unité du réacteur pour vérifier que le poids approprié de l’ammoniac a été ajouté en fonction des calculs de la feuille de calcul. 6. Commencer le chauffage et surveiller la réaction Branchez le moniteur de température sur le thermocouple et le ruban chauffant au contrôleur de température. Enregistrez la température initiale et la pression du réacteur à la suite de l’ajout d’ammoniac (début du temps de résidence). Ajustez manuellement le contrôleur de température pour amener le réacteur à la température fixée. L’objectif est d’atteindre le point fixé en lt;5 min. Enregistrez la pression et la température du réacteur toutes les 3 minutes jusqu’à la fin de l’heure de résidence. À la fin du temps de résidence, déconnectez le réacteur du contrôleur de température et du thermocouple, retirez le réacteur du support et ouvrez lentement la soupape de dégagement de balle à l’intérieur du capot de fumée.REMARQUE : Portez toujours un écran facial pendant cette étape. 7. Fermer le système Après avoir laissé refroidir le réacteur pendant quelques minutes, utilisez une clé à cliquetis pour ouvrir les pinces du réacteur. Déchargez la biomasse et la laine de verre du réacteur à l’intérieur d’un capot de fumée. Afin d’éviter la contamination aéroportée de la biomasse lorsque l’ammoniac résiduel s’évapore, il est préférable de sécher à l’intérieur d’une boîte de séchage fermée à l’intérieur d’un espace ventilé. Nettoyer le réacteur avec de l’eau distillée jusqu’à ce que l’eau soit claire et permettre aux réacteurs de sécher. S’il est encore ouvert, fermez toutes les vannes et connectez-vous au cylindre d’ammoniac. Fermez toutes les vannes sur la ligne d’azote. Éteignez le contrôleur de température, le moniteur de température, l’équilibre, la pompe à seringue et la minuterie.AVERTISSEMENT: Si l’on prévoit d’exécuter plus de réactions, il n’est pas nécessaire d’évacuer le petit cylindre d’ammoniac. Cependant, s’il n’y a pas de plan pour exécuter plus d’expériences, pour la sécurité, il est préférable d’évacuer le petit cylindre dans le capot à la fin de l’expérience. Pour ce faire, il est important de laisser les vannes ouvertes car le dégagement de l’ammoniac peut causer la formation de glace qui peut bloquer certaines lignes. Au fur et à mesure que les lignes dégèlent, de l’ammoniac supplémentaire peut être libéré. Assurez-vous toujours d’avoir le fonctionnement de la ventilation tout en permettant au système de s’évacuer. Toute biomasse traitée à l’ammoniac, même si elle n’est pas destinée à être utilisée, doit être séchée dans le capot de fumée pendant la nuit pour permettre l’évaporation de l’ammoniac résiduel. Il ne peut pas être immédiatement éliminé à la poubelle.

Representative Results

Après le prétraitement AFEX, la biomasse est de couleur plus foncée, mais par ailleurs visuellement inchangée(figure 3). Le processus AFEX génère un matériau très digestible à une variété d’échelles en plus de celle décrite dans ce protocole. Ici, nous avons prétité le même échantillon de corn stover dans notre petit 200 ml, lit emballé, système à l’échelle du banc; un plus grand 5 gallons, agité réacteur Parr; et le réacteur pilote de MBI. Les conditions utilisées pour les deux réacteurs plus petits (c.-à-d. 200 ml et 5 gallons) étaient de 1,0 g NH3: biomasse sèche, 0,6 g H2O:g biomasse sèche, pendant 30 min à 100 à 5 oC. L’AFEX4 à l’échelle pilote a été réalisée sur le même matériau à 0,6 g de biomasse sèche NH3g, 0,6 g H2O:g de biomasse sèche, pendant 30 min à 100 à 5 oC. Les détails concernant les protocoles utilisés pour effectuer des prétraitements AFEX à plus grande échelle sont fournis dans les informations à l’appui (voir Fichier supplémentaire 1). Les « critères de contrôle de la qualité » suivants ont été établis en fonction de la température cible du prétraitement AFEX. Si, après avoir atteint le point fixé, la température du réacteur s’éloigne de 10 oC à partir du point d’ensemble, l’expérience doit être interrompue. Si la température cible (dans les 5 oC) n’est pas atteinte dans les 5 minutes après le pompage de l’ammoniac, avortez l’expérience. En outre, l’efficacité du prétraitement pour le processus AFEX peut être testée à l’aide de cocktails enzymatiques cellulolytiques pour hydrolyser les polysaccharides accessibles en sucres fermentables. Les échantillons ont été hydrolysés enzymatiquement pendant 72 heures à 6 % de chargement de glucan, pH 5.0, 50 ‘C, et 250 tr/min dans un incubateur secouant. Un cocktail commercial d’enzymes composées de 60% de cellulase (CTec3):40% hemicellulase (HTec3 ou NS22246) sur une base de chargement de protéines totales fixe chargée à 15 mg d’enzyme/g glucan a été utilisé pour tous les essais de saccharification. Les résultats(figure 4) démontrent que le prétraitement AFEX augmente considérablement le rendement des sucres fermentables dans tous les cas. De plus, les rendements d’hydrolyse de cellulose/xylan pour la biomasse prétraitée à l’aide du procédé AFEX à l’échelle de laboratoire sont comparables au plus grand réacteur Parr de 5 gallons et au procédé AFEX du lit emballé à l’échelle pilote de MBI. Figure 1. Schémat des étapes impliquées dans l’exploitation à l’échelle pilote du réacteur AFEX de MBI pour prétrerating biomasse lignocellulosique entièrement intégrée à un recyclage efficace de l’ammoniac. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2. Schémas de laboratoire-échelle de A) système de livraison d’ammoniac et B) petit réacteur de prétraitement AFEX de 200 mL utilisé pour effectuer le processus AFEX décrit dans le protocole vidéo. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3. La biomasse prét traitée AFEX a une morphologie brute très similaire par rapport à la biomasse non traitée, en plus d’être légèrement plus foncée dans la couleur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4. Les rendements de glucose et de xylose obtenus après 72 hydrolyse enzymatiques de 6% de chargement de glucan AFEX est montré ici. Tous les essais de saccharification ont été effectués en double avec des valeurs moyennes (m) rapportées ici. Les écarts standard (1) sont signalés ici comme des barres d’erreur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Fichier supplémentaire 1: Protocoles supplémentaires S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. Tableau supplémentaire 1 : Système de livraison d’ammoniac et cadre de jambe S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le protocole AFEX décrit comment traiter les matières végétales en présence d’ammoniac anhydre et d’eau à des températures élevées afin d’augmenter la digestibilité du matériau de prétraitement par les enzymes et/ou les microbes cellulolytiques. AFEX est très efficace sur les espèces de monocots graminoïdes (p. ex., stover de maïs, herbe de commutation, miscanthus, paille de riz, paille de blé et bagasse de canne à sucre) en raison de l’efficacité du processus pour couper les liens ester qui sont naturellement abondants dans ces matériaux31. AFEX est beaucoup moins efficace sur la biomasse dérivée des dicots et des gymnases (feuillus, résineux et forbes indigènes)32,33 en raison de la plus faible proportion de liens à base de lignine-hydrates de carbone. Cependant, lorsque ces liens sont introduits dans les parois cellulaires ligneuses à l’aide de la biotechnologie végétale, le processus de prétraitement AFEX devient beaucoup plus efficace34.

Le clivage des liens ester permet de retirer certains composants de biomasse du matériau, mais redécorés comme extractifs sur les surfaces de la paroi cellulaire externe, ce qui entraîne la formation de trous à l’échelle nanométrique qui facilitent la pénétration et l’action des enzymes cellulolytiques6. AfEX prétraité stover maïs a montré une augmentation approximativement 3 fois du taux de glucose et de libération de xylose suivant l’hydrolyse enzymatique dans des conditions solides élevées comparées au matériel non traité. Les prétraitements d’ammoniaque produisent également moins et beaucoup moins de produits de dégradation inhibiteur que le prétraitement acidedilué 35. Une comparaison précédente de l’AFEX et de la dilution du maïs traité à l’acide a montré que le prétraitement acide dilué produit 316 % plus d’acides, 142 % plus aromatiques et 3 555 % plus d’aldéhydes furan que l’AFEX36, qui peuvent tous être inhibiteurs pour les micro-organismes35,37. Comme l’AFEX est un processus sec à sec, il n’y a pas non plus de perte de sucres en tant que flux liquide dilué qui ne peut pas être économiquement utilisé pendant l’hydrolyse enzymatique. Cependant, cela conduit à des complications que les enzymes avec la cellulose-dégradante et la capacité de hémicellulose-dégradante sont nécessaires pour décomposer complètement les polysaccharides de paroi cellulaire pendant l’hydrolyse enzymatique dans les sucres fermentables mélangés comme le glucose et le xylose. Des oligomers hémicellulosiques ont été rapportés pour inhiber l’activité de cellulase38, qui pourrait nécessiter une charge d’enzyme plus élevée pour maintenir un rendement final élevé de sucre. Cependant, l’optimisation des cocktails enzymatiques appropriés peut réduire l’utilisation globale d’enzymes pendant la saccharification de la biomasse prét traitée AFEX39,40,41,42,43,44,45. Pendant le processus de prétraitement AFEX l’hydrolyse et l’ammonolyse des liens d’ester mène à la formation d’acide et de produits de amide dans la biomasse pré traitée (par exemple, acide acétique/acétamide, acide ferulique/ferulamide, acide coumarique/coumarylamide)36. Bien que la formation de amides ait été montrée pour aider le processus de fermentation, leur présence à des concentrations très élevées dans la matière première pré traitée pourrait être un souci si l’alimentation des animaux prétraités biomas. La pré-hydrolyse des liens ester avec des alcalins tels que NaOH ou Ca(OH)2 avant le prétraitement AFEX peut être utilisée pour résoudre le problème.

Il y a un certain nombre de considérations de sécurité à garder à l’esprit lorsque vous travaillez avec de l’ammoniac anhydre pendant le processus AFEX. L’ammoniac anhydre réagit avec le cuivre, le laiton, l’aluminium, l’acier carbonique et les polymères fluoroelastomères courants utilisés dans les phoques (p. ex. Viton, etc.). Tout tuyau ou composant du réacteur qui peut entrer en contact avec l’ammoniac doit être fabriqué à partir d’acier inoxydable, et les joints, les sièges de vanne et les joints de raccordement rapides doivent être fabriqués à partir de téflon ou Kalrez si possible. L’ammoniac n’est pas considéré comme un produit chimique toxique, mais il est toujours dangereux en raison de ses propriétés hygroscopiques et cryogéniques. Il cible facilement et peut gravement endommager les muqueuses dans les yeux et le système respiratoire. L’ammoniac est un liquide cryogénique et les fuites d’ammoniac peuvent causer de graves engelures en raison d’un contact direct avec le flux de gaz ou de l’équipement réfrigéré. L’ammoniac est immédiatement dangereux pour la vie et la santé (IDLH) à des concentrations supérieures à 300 ppm. Les travailleurs doivent évacuer immédiatement si la concentration dépasse 50 ppm. Il est recommandé aux exploitants de porter un moniteur d’ammoniac calibré pour avertir des concentrations dangereuses dans leur voisinage. L’installation de capteurs avec des alarmes dans la zone de travail principale est également conseillée. Les travailleurs qui manipulent de l’ammoniac doivent être correctement formés et porter des vêtements de protection tels que des respirateurs d’évacuation équipés de cartouches de méthylamine, des gants cryogéniques et protecteurs contre la chaleur, et être prêts à gérer les situations d’urgence. En cas d’exposition à l’ammoniac anhydre, l’exploitant doit se déplacer en lieu sûr et rincer immédiatement la zone touchée avec de l’eau pendant au moins 15 minutes. Le processus de prétraitement de l’ammoniac doit être effectué à l’intérieur d’un capot de fumée, et le cylindre d’ammoniac doit être stocké dans un capot de fumée ou une armoire ventilée. Après l’expérience, la biomasse prétraitée aura de l’ammoniac libre résiduel et doit être séchée dans le capot pendant la nuit ou dans une boîte de séchage ventilée sur mesure avant le stockage dans des sacs en plastique à température ambiante pour des expériences de suivi. D’autres considérations clés en matière de sécurité comprennent l’installation d’un système de livraison d’ammoniac avec un débitmètre qui aidera à livrer précisément de l’ammoniac au réacteur et d’un réacteur conçu pour supporter au moins 1,5 fois la pression que le processus de prétraitement subira (p. ex., pour la manipulation du processus AFEX à 2 x 106 Pa, la pression minimale du réacteur devrait être de 3 x 106 Pa).

Le prétraitement AFEX est une méthode prometteuse pour produire de la biomasse végétale hautement digestible qui peut être utilisée directement comme aliment pour animaux ou comme matière première pour produire des combustibles et des produits chimiques. Au-delà de ces deux industries, l’AFEX pourrait s’utiliser dans d’autres domaines tels qu’une matière première bio-renouvelable pour la fabrication de biomatériaux, ou comme matière première pour la production de biogaz. Le processus à l’échelle du laboratoire peut être effectué dans un laboratoire équipé de précautions adéquates en matière d’espace et de sécurité ventilés, et nos travaux actuels confirment que ce processus AFEX réduit montre des résultats similaires à ceux générés dans un réacteur AFEX à l’échelle et/ou pilote. Le processus AFEX à l’échelle du laboratoire peut être utilisé pour tester les matières premières, les conditions de traitement et les applications d’une manière plus élevée, tout en fournissant une attente raisonnable de la façon dont le processus fonctionnerait à l’échelle pilote ou industrielle.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce matériel est basé sur des travaux soutenus en partie par le Great Lakes Bioenergy Research Center, U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research sous les numéros de prix DE-SC0018409 et DE-FC02-07ER64494. Rebecca Ong reconnaît le soutien partiel de l’Université technologique du Michigan (financement de démarrage). Shishir Chundawat reconnaît le soutien partiel du prix CBET de la National Science Foundation des États-Unis (1604421), du prix Ralph E. Powe de l’ORAU et de la Rutgers School of Engineering (Startup Funding). Bruce Dale reconnaît le soutien partiel du bureau d’AgBioResearch de l’Université d’État du Michigan et du National Institute of Food and Agriculture de l’USDA. Venkatesh Balan reconnaît le soutien partiel de l’État du Texas et de l’Université de Houston (Startup Funding). Les employés de MBI reconnaissent le soutien partiel de la fondation du département américain de l’Énergie et de l’Université d’État du Michigan. Enfin, nous aimerions dédier ce document à notre mentor et coauteur Prof. Bruce Dale pour nous avoir incités à poursuivre en collaboration notre rêve de fabriquer des biocarburants cellulosiques durables.

Materials

Safety Equipment/PPE
Ammonia Monitor CanarySense BW GAXT-A-DL Single gas detector, Ammonia (NH3), 0 to 100 ppm
Cryogenic gloves Amazon B01L8WA238/B01L8WA1H0/B01L8WA1O8 Keep hands protected when handling liquid ammonia
Ear muffs 3M H7A Ear muffs to protect hearing when releasing ammonia at end of pretreatment
Face shield – – Wear while handling ammonia
Heat protective gloves Grainger 2EWX1/2EWX2/2EWX3 Showa heat resistant gloves, max temperature 500°F
Nitrile gloves – – Wear while mixing biomass to prevent contamination
Reagents
Anhydrous Ammonia Compressed Gas Cylinder – – An anhydrous ammonia compressed gas cylinder with a dip tube is required for this process. The dip tube is essential in order to withdraw liquid ammonia from the cylinder.
Distilled water – – Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading
Milled or Chopped Corn Stover – – Corn stover is not readily commercially available. Contact local farmers or agricultural extension if you wish to locate some.
Nitrogen Compressed Gas Cylinder – –
Equipment
Ammonia Cylinder Adapter – – CGA fitting that depends on the gas cylinder. Matheson is a good source. Some require teflon gaskets. This connects the cylinder to the ammonia delivery system. A regulator is not necessary as the system uses liquid ammonia.
Ammonia Delivery System (Figure 4) Swagelok Misc. Stainless steel pressure cylinder and components, valves, check valves, and gauges were used for all lines potentially in contact with ammonia.
Analytical Balance Sartorius CPA4202S Balance used for preparing biomass and weighing the reactors. Toploading balance, 4200g x 0.01g
Chemraz O-rings Harvard Apparatus 5013091 Ammonia-resistant o-rings for the SS syringe
Custom Tubular Reactors (Figure 3) Parts were purchased from McMaster-Carr, Swagelok, Omega, and Motion Industries (Dixon Fittings) Misc. To be compatible with ammonia, the custom reactor was constructed from stainless steel components (sanitary tube and fittings, compression fittings, quick connect, pressure gauge, thermocouple), and teflon gaskets. The maximum pressure rating of the vessel is 1500 psig, which is the maximum pressure rating of the bolted sanitary clamps.
Drying Box – – Optional: an enclosed system for drying is necessary if planning to do microbial experiments to avoid contamination. Avoid drying at elevated temperatures.
High Pressure Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3311 Infuse/Withrdraw PHD ULTRA HPSI Programmable Syringe Pump for transferring liquid ammonia
Moisture Analyzer Sartorius MA35 Moisture analyzer for determining moisture content of biomass prior to pretreatment.
Nitrogen Delivery Misc. Misc. Nitrogen compressed gas cylinder, inert gas regulator (at least 1000 psig max pressure rating), lines, and valves.
Ratchet wrench and 7/8" socket – – Ratchet and socket to quickly tighten and open bolts on the sanitary clamp. Can be purchased anywhere.
Retractable Thermocouple Cables Omega RSC-K-3-4-5 Retractable thermocouple cable. You need one for each reactor.
Stainless Steel Syringe Harvard Apparatus 702261 Stainless steel syringe for tranferring ammonia to the reactors.
Temperature Monitor Omega HH12B Dual input temperature monitor. You need one for every two reactors.
Voltage Controller McMaster-Carr 6994K11 Variable-Voltage Transformer for controlling heating to the reactors. You need one for each reactor.
Supplies
Metal Scoops, Spoons and/or Spatulas – – For transferring biomass for weighing, mixing, transferring into the reactor and removing from the reactor at the end of the run
Plastic Bowls or Tubs – – Used for mixing the biomass with the water. Any bowl or tub could be used.
Spray Bottle – – Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading
Wide-Mouth Funnel – – Any funnel that has a bottom opening 0.5-1.0 inches diameter.
Wooden Dowel – – 1-1.5" diameter wooden dowel to assist with loading/unloading the reactor
Consumables
Glass Wool Sigma-Aldrich CLS3950-454G For packing the top of the reactor to prevent biomass escape and clogging the tubing
Plastic Press-to-Close Bags McMaster-Carr 1959T24 Bags for storing processed samples and for transferring to drying box
Plastic Tote – – Used to transfer pretreated biomass to an alternate location for drying
Plastic Weighboats or Metal Trays – – Used to catch the biomass when removing from the reactors, and for storing the samples while drying
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Chundawat, S. P. S., Pal, R. K., Zhao, C., Campbell, T., Teymouri, F., Videto, J., Nielson, C., Wieferich, B., Sousa, L., Dale, B. E., Balan, V., Chipkar, S., Aguado, J., Burke, E., Ong, R. G. Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass. J. Vis. Exp. (158), e57488, doi:10.3791/57488 (2020).
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