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Environment

Impenitta di espansione della fibra di Ammonia (AFEX) di biomassa lignocellulosica

Published: April 18, 2020
doi:
10.3791/57488
, , , , , , , , , , , , , ,
1Department of Chemical and Biochemical Engineering,Rutgers-State University of New Jersey, 2Michigan Biotechnology Institute (MBI), 3Department of Chemical Engineering and Materials Science,Michigan State University, 4Engineering Technology Department, Biotechnology Program, College of Technology,University of Houston, 5Department of Chemical Engineering,Michigan Technological University

Summary

L’espansione della fibra di ammoniaca (AFEX) è una tecnologia di pretrattamento termochimica in grado di convertire la biomassa lignocellulosica (ad esempio, mais stover, paglia di riso e bagasse di canna da zucchero) in una materia prima altamente digeribile sia per i biocarburanti che per le applicazioni di mangimi per animali. Qui, descriviamo un metodo su scala di laboratorio per condurre il pretrattamento AFEX sulla biomassa lignocellulosica.

Abstract

I materiali lignocellulosici sono materie prime di origine vegetale, come i residui delle colture (ad esempio, lo stover del mais, la paglia di riso e la bagasse della canna da zucchero) e le colture energetiche appositamente coltivate (ad esempio, miscanthus e switchgrass) che sono disponibili in grandi quantità per produrre biocarburanti, biochimici e mangimi per animali. I polisaccheridi vegetali (ad esempio, cellulosa, emicellulosa e pectina) incorporati all’interno delle pareti cellulari sono altamente recalcitranti verso la conversione in prodotti utili. L’espansione della fibra di ammoniaca (AFEX) è un pretrattamento termochimico che aumenta l’accessibilità dei polisacharidedi agli enzimi per l’idrolisi negli zuccheri fermentabili. Questi zuccheri rilasciati possono essere convertiti in combustibili e sostanze chimiche in una bioraffineria. Qui, descriviamo un processo AFEX batch su scala di laboratorio per produrre biomassa pretrattata su scala grammo senza alcun riciclo di ammoniaca. Il processo su scala di laboratorio può essere utilizzato per identificare condizioni ottimali di pretrattamento (ad esempio, carico di ammoniaca, carico d’acqua, carico di biomassa, temperatura, pressione, tempo di residenza, ecc.) e genera quantità sufficienti di campioni pretrattati per la caratterizzazione fisica dettagliata e l’analisi enzymatica/microbica. La resa di zuccheri fermentabili da idrolisi enzimatica dello stover di mais pretrattata utilizzando il processo AFEX su scala di laboratorio è paragonabile al processo AFEX su scala pilota in condizioni di pretrattamento simili. Questo documento ha lo scopo di fornire una procedura operativa standard dettagliata per il funzionamento sicuro e coerente di reattori su scala di laboratorio per l’esecuzione del pretrattamento AFEX della biomassa lignocellulosica.

Introduction

L’espansione della fibra di ammoniaca (AFEX) è un pretrattamento termochimico che utilizza l’ammoniaca volatile come principale reattore per il pretrattamento della biomassa cellulosica. Questo processo è stato originariamente inventato da Bruce Dale per ridurre in modo conveniente la ricalcolo della biomassa lignocellulosica e migliorare la decostruzione biologicamente catalizzato della biomassa pretrattata in zuccheri fermentabili1,2. A differenza della maggior parte degli altri pretrattamenti termochimici a base di acquosi3, AFEX è un processo secco-asciutto che non provoca cambiamenti significativi nella composizione della biomassa e non richiede alcuna fase di lavaggio con la produzione e le spese di rifiuti associati. Il recupero dell’ammoniaca volatilia in eccesso è stato dimostrato su scala pilota, con conseguente riduzione dei costi di produzione e lavorazione dei rifiuti. Il sistema di reattori AFEX a letto imballato su scala pilota sviluppato da MBI (Figura 1) recupera l’ammoniaca residua utilizzando lo stripping a vapore e trasferisce l’ammoniaca calda e concentrata in un nuovo letto imballato4,5. In seguito al pretrattamento dell’AFEX, le piccole quantità di azoto incorporate nella biomassa sono utilizzabili come azoto non proteico da animali ruminanti e microrganismi. Inoltre, alterando l’ultrastruttura della biomassa attraverso vari meccanismi fisici,6,7,8, AFEX aumenta l’accessibilità della biomassa agli enzimi attivi dai carboidrati (CA-imes) e aumenta i tassi di idrolisi polisaccharides di diversi colori8,9, che aumenta anche la sua disidratabilità da parte degli animali ruminanti tramite il loro microbioma cellulolitico4,10,11. Gli agricoltori hanno a lungo impiegato una versione più semplice di questo metodo per aumentare la digeribilità dei foraggi dei ruminanti incubando la biomassa per giorni o settimane sotto teloni di plastica in presenza di bassi carichi di ammoniaca anidrosiana (<4% w/w base di biomassa secca) e pressioni ambientali e temperature10,11.

L’ammoniaca idroelettrica è stata studiata per il suo potenziale di delignificare il legno negli anni ’50 e come sostanza chimica della cellulosa nei primi anni ’7013,14,15,16,17,18. All’inizio degli anni ’80, l’ammoniaca concentrata pressurizzata ad alta temperatura (>30% NH4OH) in condizioni sub-critiche è stata utilizzata per la prima volta nel laboratorio di Dale per migliorare la digeribilità enzimatica e la fermentabilità microbica della biomassa lignocellulosica19. Questo processo ha subito diversi cambiamenti di nome nel corso degli anni, a partire dall’esplosione di congelamento dell’ammoniaca, e poi dall’esplosione della fibra di ammoniaca, e infine, dall’espansione della fibra di ammoniaca, o semplicemente aAFEX. In questo stesso periodo (metà degli anni ’80), DuPont (ora Dow-DuPont) ha anche esplorato utilizzando processi di pretrattamento basati sull’ammoniaca acriride supercritica e quasi critica per aumentare la digeribilità della biomassa20,21,22. Negli ultimi decenni, si è maggiore enfasi sull’utilizzo di soluzioni diammonia acquose diluite come reagente di pretrattamento, compreso il riciclo/percolazione di ammoniaca23 (ARP), ammollo nell’ammoniaca acquosa (SAA), o il processo Dow-DuPont senza riciclo dell’ammoniaca24. Alcuni altri metodi hanno esaminato l’uso dell’ammoniaca anidroferma (ammoniaca anidropio a bassa umidità (LMAA) e pretrattamento di ammoniaca a basso liquido25 (LAA). Due nuove tecnologie avanzate di pretrattamento di tipo organosolv che utilizzano ammoniaca all’anidrio liquido26,,27 e soluzioni a base di sale ammoniaca28 a carichi liquidi ad alto solido-liquido sono state recentemente sviluppate che consentono la frazione di lignina selettiva e l’idrolisi enzimatica ad alta efficienza della biomassa cellulosica pretrattata a carichi enzimatici ultra-bassi. Un recente articolo di revisione ha evidenziato le somiglianze e le differenze distinte tra le varie forme di pretrattamenti a base di ammoniaca29. Tuttavia, fino a pocotempo fa, nonc’erano dimostrazioni su scala pilota di processi di pretrattamento basati sull’ammoniaca (come AFEX) accoppiati in modo efficiente con il riciclo chimico a circuito chiuso di ammoniaca concentrata utilizzata nel processo.

In questo articolo, descriviamo in dettaglio il protocollo AFEX più comunemente usato per pretrattare la biomassa cellulosica su scala di laboratorio per produrre scale grammo di biomassa pretrattata (ad esempio, da 1 a diversi 100 g). Tipicamente, la biomassa viene miscelata con acqua (0,1–2,0 gdibiomassa secca O/g) e caricata in un tubolare in acciaio inossidabile costruito su misura o in reattori di tipo Parr. L’ammoniaca idroelettrica viene quindi aggiunta al reattore (0,3–2,0 g di NH3/g di biomassa secca) e la miscela viene riscaldata alla temperatura di reazione desiderata (60–180 gradi centigradi). Le pubblicazioni precedenti sul processo AFEX degli anni ’80-’90 hanno iniziato il tempo di residenza pre-trattamento (ad esempio, 5-60 min) immediatamente dopo la rampa di temperatura. Tuttavia, poiché le reazioni si verificano non appena l’ammoniaca viene aggiunta al reattore, l’attuale procedura AFEX consiste nell’iniziare a monitorare il tempo di residenza immediatamente dopo l’aggiunta di ammoniaca al reattore. Per temperature pari o superiori a 90 gradi centigradi, è spesso necessario preriscaldare la biomassa prima di caricare l’ammoniaca per mantenere la rampa di temperatura iniziale ad un periodo di tempo minimo (cioè, <5 min). Al termine del tempo di residenza, viene aperta una valvola per liberare rapidamente la pressione e il contenuto della fase gassosa in un'adeguata cappa di fumi chimici. La rapida conversione dell'ammoniaca dalla fase liquida a quella gassosa provoca anche il raffreddamento del reattore. I reattori di piccole dimensioni (volume del reattore 100 mL) possono richiedere più tempo per raffreddarsi. Per la sicurezza dell’utente, su larga scala (>100 g di ammoniaca per corsa reattore), si raccomanda l’epurazione con azoto per rimuovere quanta più ammoniaca residua possibile dalla nave e assistere nel raffreddamento del contenuto del reattore prima dello scarico. In genere, non viene effettuato alcun tentativo su scala di laboratorio per riciclare e/o recuperare l’ammoniaca. Una delle principali sfide progettuali per aumentare il processo di pretrattamento AFEX è stato il riciclaggio dell’ammoniaca con costi di capitale e operativi minimi. Inoltre, l’aggiunta di ammoniaca liquida alla biomassa generalmente guida il lampeggio parziale del liquido che raffredda la biomassa, richiedendo il riscaldamento della miscela biomassa-ammoniaca prima di poter iniziare il trattamento AFEX. Piuttosto che aggiungere l’ammoniaca come liquida, l’aggiunta di vapore di ammoniaca alla biomassa offre due vantaggi: in primo luogo, l’elevata porosità della biomassa sfusa consente di trasportare rapidamente il vapore di ammoniaca, con conseguente distribuzione anche dell’ammoniaca in tutta la biomassa. In secondo luogo, il vapore ammoniaco si dissolve prontamente ed esotermicamente nell’acqua immersa nella biomassa umida, con conseguente generazione di calore che riscalda rapidamente e uniformemente la biomassa. Per sfruttare questi vantaggi, sia il laboratorio MSU Dale che MBI hanno sviluppato metodi di trattamento AFEX utilizzando il vapore ammoniaco. Il laboratorio di Dale ha sviluppato il processo Gaseous Ammonia Pretreatment (GAP)30, e MBI ha sviluppato il processo del reattore AFEX letto imballato (Figura 1)4, che è stato dimostrato su scala pilota. Il sistema di reattore AFEX letto imballato è in grado di funzionare in modalità semi-batch con il riciclaggio completo dell’ammoniaca utilizzando un metodo di stripping a vapore4,5. Questo nuovo processo su scala pilota MBI sfrutta le caratteristiche chimiche e fisiche dell’ammoniaca per pretrattare in modo efficiente la biomassa, riciclando in modo efficiente l’ammoniaca.

Qui, presentiamo un contorno dettagliato per condurre il pretrattamento AFEX di stover di mais su scala di laboratorio utilizzando reattori tubolari con volume da 200 mL su misura (Figura 2). I campioni pretrattati AFEX sono stati digeriti in zuccheri fermentabili utilizzando cocktail di enzimi cellulolitici disponibili in commercio per dimostrare l’efficacia dei processi di pretrattamento. I risultati dell’idrolisi enzimatica per il reattore AFEX su scala di laboratorio sono stati confrontati con campioni generati dal reattore AFEX su scala pilota più grande. Il nostro obiettivo è quello di fornire una procedura operativa standard per il funzionamento sicuro e coerente di reattori pressurizzati su scala di laboratorio per l’esecuzione di pretrattamento AFEX sulla biomassa cellulosica come mais stover. Ulteriori informazioni di supporto relative alle variazioni di questo processo di pretrattamento AFEX su scala di laboratorio (ad esempio, processo AFEX letto imballato su scala pilota) sono ulteriormente evidenziate nel file pdf supplementare di accompagnamento. Una relazione dettagliata sui passaggi operativi del processo AFEX del letto imballato sarà evidenziata in una pubblicazione separata ed è disponibile su richiesta di MBI-MSU.

Protocol

1. Regolazione del contenuto di umidità da biomassa Vedere la Tabella dei materiali che delinea tutte le principali attrezzature e materiali necessari per eseguire il pretrattamento AFEX della panca o della scala di laboratorio utilizzando il reattore AFEX tubolare personalizzato ( Figura2). Determinare il contenuto totale di umidità della biomassa utilizzando un analizzatore di umidità, o un forno impostato a 105 gradi centigradi per 8 h. Per il metodo del forno, trasferire i campioni in un desiccatore resistente al calore per raffreddare per evitare l’adsordimento dell’acqua prima dell’essiccazione. Eseguire il processo in duplicazione o triplicare e calcolare il contenuto medio di umidità. Per un dato carico di biomassa secca nel reattore (qui, contiene 25 g), utilizzare il contenuto di umidità determinato al punto 1.2, per calcolare quanta biomassa umida deve essere caricata.[1]Dove mbagnato – massa totale di biomassa (base di peso umido); msecco: massa di biomassa su base a peso secco; MCTWB – contenuto di umidità da biomassa su base di peso totale Pesare questa quantità di biomassa (mbagnato) in un contenitore di plastica. Calcolare quanta acqua deve essere miscelata con la biomassa umida per ottenere il contenuto di umidità desiderato. Per lo stover di mais, questo è in genere 0,6 g di H2O per g di biomassa secca.[2]Dove macqua – massa d’acqua aggiunta al reattore (oltre all’acqua nella biomassa); xacqua – Carico d’acqua AFEX (g:g biomassa secca) Utilizzando una bottiglia spray, aggiungere lentamente questa quantità di acqua (macqua)alla biomassa che era stata precedentemente pesata e mescolare bene a mano. 2. Caricare e assemblare il reattore Assemblare il corpo del reattore posizionando un tappo e la guarnizione Teflon sul fondo del tubo del reattore. Bullone un morsetto in posizione, stringendo entrambi i dadi in modo uniforme utilizzando un rachet. Trasferire la biomassa umida alla base del reattore assemblato e posizionare una spina di lana di vetro nella parte superiore della biomassa. Posizionare una guarnizione Teflon sulla parte superiore del reattore. Assicurarsi che la regione sia priva di biomassa e lana di vetro, che potrebbe prevenire una guarizione efficace, e posizionare la testa del reattore sulla parte superiore, manovrando la termocoppia attraverso la lana di vetro e la biomassa. Imbudare il morsetto alla parte superiore del reattore utilizzando un cricchetto in modo uniforme su entrambi i lati. Pesare il reattore (mreattore) e registrare il peso. 3. Impostare il sistema del reattore e riempire il cilindro di trasferimento dell’ammoniaca Verificare che tutte le apparecchiature siano collegate e utilizzabili (controllore della temperatura, monitor temperatura, pompa di siringhe, timer). Impostare i timer sul tempo di residenza desiderato per ogni reattore e campione da eseguire. Accendere e, se si utilizza una pompa di siringa programmabile, impostare il metodo di consegna ammoniaca sulla pompa siringa.Fase 1: Ritiro.Passo 2: Attendere 15 secondi (per consentire il tempo di aprire e chiudere le valvole).Fase 3: Infusione (per trasferire l’ammoniaca nel reattore). Salva come metodo AFEX per consentire un facile riutilizzo. Verificare che tutte le valvole all’ingresso e all’esterno del piccolo cilindro di ammoniaca siano chiuse. Se il cilindro è stato utilizzato in precedenza e contiene ammoniaca/azoto residuo, la valvola A aperta lentamente sulla parte superiore del piccolo cilindro di ammoniaca per sanguinare da qualsiasi azoto e chiudere la valvola una volta che l’ammoniaca liquida inizia a sputare fuori. Per riempire il piccolo cilindro di ammoniaca, aprire il grande cilindro di ammoniaca anidroso e tutte le valvole sulla linea di ammoniaca. Valvola ad apertura lenta (B) vicino alla parte superiore del piccolo cilindro di ammoniaca fino a quando la pressione si stabilizza. Attendere 5 min prima di continuare con il passaggio successivo. Circa 120 mL di ammoniaca vengono caricati dal cilindro principale al cilindro di trasferimento durante questo periodo. Chiudere tutte le valvole tra il serbatoio di ammoniaca e il piccolo cilindro di ammoniaca, lavorando da sinistra a destra, partendo dal piccolo cilindro (valvola B) e finendo alla valvola principale sulla parte superiore del serbatoio. Impostare il regolatore di azoto a 350 psi. Aprire la valvola sul cilindro di azoto e la valvola sul regolatore collegato. Aprire la valvola C sul piccolo cilindro di ammoniaca per aggiungere lentamente l’azoto, sovrappremendo il sistema. Regolare la pressione del piccolo cilindro a 350 psi, se necessario, regolando il set point sul regolatore. Mantenere aperte le linee di azoto durante l’erogazione dell’ammoniaca. 4. Preriscaldare il reattore (per temperature di reazione di >100 gradi centigradi) Collegare il monitor della temperatura alla termocoppia e il nastro di riscaldamento al regolatore di temperatura. Regolare manualmente il regolatore della temperatura per portare il reattore fino a 60 gradi centigradi. 5. Caricare il reattore con ammoniaca Accendere la pompa della siringa se non è già accesa. Calcolare il volume di ammoniaca richiesto in base al carico di ammoniaca desiderato (ad esempio biomassa secca) e a una calibrazione dell’ammoniaca precedentemente determinata.[3]NOTA: poiché la pompa di ammoniaca viene caricata su base volumeizzata, al primo utilizzo, calibrare per convertire dalla massa richiesta al volume. Seguire la stessa procedura utilizzata per l’AFEX, ma terminare la corsa (vent il reattore) immediatamente dopo aver caricato l’ammoniaca e pesata. Seguire la stessa procedura per scaricare il reattore. Impostare il metodo per caricare la quantità corretta di ammoniaca: Selezionare il metodo AFEX dalla sezione 3.3. Premete Step Definition (Definizione del Passo Stampa) Fase: 1 . Impostare il volume oil tempo di destinazione . Digitare il volume richiesto in mL utilizzando il tastierino numerico e premere il segno di spunta verde. Se sono necessari più di 85 mL, immettere il volume di destinazione come metà della quantità specificata nel foglio di calcolo e riempire due volte il reattore utilizzando lo stesso volume di siringa. Ripetere i passaggi da 5.3.2 a 5.3.4 per “Passaggio: 3”. Premere il pulsante Indietro. Aprire la valvola (D) sul fondo del piccolo cilindro di ammoniaca verso lo scarico, quindi chiuderla una volta che l’ammoniaca residua è uscita. Aprire la valvola (E) all’estremità della pompa della siringa verso la parte anteriore del cofano del fume, quindi aprire la valvola (F) per rilasciare qualsiasi ammoniaca residua. Chiudere le valvole (E) e (F). Scollegare il reattore dal monitor della temperatura e dal regolatore della temperatura. Collegare il reattore alla connessione rapida. Valvola aperta (D) verso il piccolo cilindro di ammoniaca e la valvola aperta (E) verso il piccolo cilindro di ammoniaca. Premere la freccia verde sulla pompa per avviare la sequenza e attirare l’ammoniaca nella siringa. Quando la siringa si arresta automaticamente per il periodo di attesa, ruotare la valvola della siringa (E) verso il reattore e la valvola di inzione del reattore in modo che sia rivolta verso il gambo di collegamento rapido.Dopo il ritardo, la siringa inizierà l’infusa, fermandosi automaticamente al set point. Se sono necessari più di 85 mL di ammoniaca, ripetere i passaggi da 5,7 a 5,9. Chiudere la valvola del reattore e la valvola (D). Aprire la valvola (F) per rilasciare l’ammoniaca residua dalla siringa, quindi chiudere la valvola (F) e chiudere la valvola (E). Aprire la valvola (D) verso lo scarico, quindi chiuderla una volta che l’ammoniaca residua è rimasta. Indossando guanti criogenici, rimuovere il reattore dalla connessione rapida. Fare attenzione a potenziali spruzzi di ammoniaca. Utilizzare la linea di sfiato del tronco di elefante per sfogare l’ammoniaca rilasciata, se necessario. Avviare il timer per il reattore appropriato. Pesare l’unità del reattore per verificare che il peso appropriato dell’ammoniaca sia stato aggiunto in base ai calcoli del foglio di calcolo. 6. Iniziare il riscaldamento e monitorare la reazione Collegare il monitor della temperatura alla termocoppia e il nastro di riscaldamento al regolatore di temperatura. Registrare la temperatura e la pressione iniziali del reattore dopo l’aggiunta di ammoniaca (inizio del tempo di residenza). Regolare manualmente il regolatore della temperatura per portare il reattore alla temperatura impostata. L’obiettivo è quello di raggiungere il set point in <5 min. Registrare la pressione e la temperatura del reattore ogni 3 min fino alla fine del tempo di soggiorno. Alla fine del tempo di residenza, scollegare il reattore dal regolatore della temperatura e dalla termocoppia, rimuovere il reattore dal supporto e aprire lentamente la valvola di rilascio della palla all’interno del cofano del fume.NOTA: Indossare sempre uno scudo facciale durante questo passaggio. 7. Arrestare il sistema Dopo aver lasciato raffreddare il reattore per alcuni minuti, utilizzare una chiave a cricchetto per aprire i morsetti sul reattore. Scaricare la biomassa e la lana di vetro dal reattore all’interno di un cappuccio fumatore. Al fine di prevenire la contaminazione aerea della biomassa quando l’ammoniaca residua evapora, è meglio asciugare all’interno di una scatola di essiccazione chiusa all’interno di uno spazio ventilato. Pulire il reattore con acqua distillata fino a quando l’acqua non scorre libera e lasciare asciugare i reattori. Se è ancora aperto, chiudere tutte le valvole e collegarle al cilindro di ammoniaca. Chiudere tutte le valvole sulla linea di azoto. Spegnere il controller della temperatura, il monitor della temperatura, l’equilibrio, la pompa della siringa e il timer.AVVISO: Se si pianifica di eseguire più reazioni, non è necessario sfogare il piccolo cilindro di ammoniaca. Tuttavia, se non vi è alcun piano per eseguire più esperimenti, per la sicurezza è meglio sfogare il piccolo cilindro nel cofano alla fine dell’esperimento. Quando si esegue questa operazione, è importante lasciare le valvole aperte in quanto il rilascio di ammoniaca può causare la formazione di ghiaccio che può bloccare alcune linee. Man mano che le linee si scongelano, è possibile rilasciare ulteriore ammoniaca. Assicurarsi sempre di avere il funzionamento di ventilazione, consentendo al sistema di sfogarsi. Qualsiasi biomassa trattata con ammoniaca, anche se non è destinata ad essere utilizzata, deve essere essiccata nella cappa dei fumi durante la notte per consentire l’evaporazione dell’ammoniaca residua. Non può essere smaltito immediatamente nella spazzatura.

Representative Results

A seguito del pretrattamento aFEX, la biomassa è di colore più scuro, ma altrimenti immutata visivamente (Figura 3). Il processo AFEX genera un materiale altamente digeribile su una varietà di scale oltre a quello delineato in questo protocollo. Qui, abbiamo pretrattato lo stesso campione di stover di mais nel nostro piccolo sistema da 200 mL, a letto imballato, in scala da banco; un più grande 5 gallone, mescolato reattore Parr; e il reattore pilota di MBI. Le condizioni utilizzate per i due reattori più piccoli (cioè 200 mL e scala da 5 galloni) erano 1,0 g di biomassa secca NH3:g, 0,6 g H2o:g di biomassa secca, per 30 min a 100 x 5 . L’AFEX4 su scala pilota è stata effettuata sullo stesso materiale a biomassa secca n.6 g3:g, 0,6 g H2O:g di biomassa secca, per 30 min a 100 x 5 gradi centigradi. I dettagli relativi ai protocolli utilizzati per lo svolgimento del pretrattamento AFEX su scale più grandi sono forniti nelle informazioni di supporto (vedere il file supplementare 1). Sono stati stabiliti i seguenti “criteri di controllo della qualità” in base alla temperatura prevista per il pretrattamento dell’AFEX. Se dopo aver raggiunto il set point, la temperatura del reattore si esconda a 10 gradi centigradi dal set point, l’esperimento deve essere interrotto. Se la temperatura di destinazione (entro 5 gradi centigradi) non viene raggiunta entro 5 min dopo il pompaggio dell’ammoniaca, interrompere l’esperimento. Inoltre, l’efficacia del pretrattamento per il processo AFEX può essere testata utilizzando cocktail di enzimi cellulolitici per idrolizzare i polisaccaridi accessibili in zuccheri fermentabili. I campioni sono stati idrolizzati in modo iciattico per 72 ore al 6% di carico glucano, pH 5,0, 50 c e 250 rpm in un’incubatrice di agitazione. Un cocktail commerciale di enzimi composto da 60% cellulase (CTec3):40% emicellulase (HTec3 o NS22246) su una base di carico totale delle proteine fissa caricata a 15 mg enzima/glucanè è stato impiegato per tutti i saggi di saccarificazione. I risultati (Figura 4) dimostrano che il pretrattamento dell’AFEX aumenta significativamente la resa degli zuccheri fermentabili in tutti i casi. Inoltre, le rese di idrolisi da cellulosa/xilan per la biomassa pretrattata utilizzando il processo AFEX su scala di laboratorio sono paragonabili al più grande reattore Parr da 5 galloni e al processo AFEX del letto confezionato su scala pilota di MBI. come illustrato nella Figura 1. Schematici dei passaggi coinvolti nell’operazione di scala pilota del reattore AFEX di MBI per il pretrattamento della biomassa lignocellulosica completamente integrata con un efficiente riciclo dell’ammoniaca. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 2. Schema del sistema di erogazione dell’ammoniaca su scala di laboratorio di A) e B) piccolo reattore pretrattamento AFEX da 200 mL utilizzato per eseguire il processo AFEX delineato nel protocollo video. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella figura 3. La biomassa pretrattata AFEX ha una morfologia lorda molto simile rispetto alla biomassa non trattata, oltre ad essere di colore leggermente più scuro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. come illustrato nella Figura 4. Le rese di glucosio e xilio ottenute dopo 72 h di idrolisi enzimatica del 6% di carico glucano di carica AFEX trattata stover di mais è mostrata qui. Tutti i saggi di saccarificazione sono stati effettuati in duplicato con valori medi (m) riportati qui. Le deviazioni standard (1s) sono riportate qui come barre di errore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. File supplementare 1: Protocolli aggiuntivi Fare clic qui per scaricare questo file. Tabella supplementare 1: Sistema di consegna dell’ammoniaca e telaio del montante Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Il protocollo AFEX descrive come trattare i materiali vegetali in presenza di ammoniaca anidroe e acqua a temperature elevate per aumentare la digeribilità del materiale pretrattamento mediante enzimi cellulolitici e/o microbi. AFEX è altamente efficace sulle specie di monotto graminoide (ad esempio, stover di mais, switchgrass, miscanthus, paglia di riso, paglia di grano e bagasse di canna da zucchero) a causa dell’efficienza del processo di fessura dei collegamenti che sono naturalmente abbondanti in questi materiali31. AFEX è molto meno efficace sulla biomassa derivata da dicot s e gimnosperme (legni duri, legni e forchette autoctone)32,33 a causa della minore percentuale di collegamenti esteri a base di lignina-carboidrati. Tuttavia, quando questi collegamenti vengono introdotti nelle pareti cellulari legnose utilizzando la biotecnologia vegetale, il processo di pretrattamento AFEX diventa molto più efficace34.

La cleavazione dei collegamenti esteri consente di rimuovere alcuni componenti della biomassa dal materiale, ma di ridepositarsi come estrattivi sulle superfici della parete cellulare esterna,6con conseguente formazione di fori su nanoscala che facilitano la penetrazione e l’azione degli enzimi celluloliti6 . Lo stover di mais pretrattato AFEX ha mostrato un aumento di circa 3 volte del glucosio e del tasso di rilascio di xilosi a seguito di idrolisi enzimatica in condizioni di solidi elevati rispetto al materiale non trattato. I pretrattamenti dell’ammoniaca producono anche meno e molto meno prodotti di degradazione inibitoria rispetto al pretrattamento dell’acido diluito35. Un precedente confronto tra AFEX e stover dimato di mais trattato con acido ha mostrato che il pretrattamento dell’acido diluito produce il 316% in più di acidi, il 142% in più di aromaticità e 3.555% in più di aldeidi furan rispettoall’AFEX 36,tutti i quali possono essere inibitori di microrganismi35,37. Poiché L’AFEX è un processo secco-asciutto, non c’è anche perdita di zuccheri come un flusso liquido diluito che non può essere utilizzato economicamente durante l’idrolisi enzimatica. Tuttavia, questo porta a complicazioni in quanto sono necessari enzimi con capacità di degradazione della cellulosa e di emicellulosa per abbattere completamente i polisacaridi della parete cellulare durante l’idrolisi enzimatica in zuccheri fermentabili misti come glucosio e xililo. Gli oligomeri emicellulosici sono stati segnalati per inibire l’attività cellulase38, che potrebbe richiedere un carico enzimatico più elevato per mantenere un’elevata resa finale di zucchero. Tuttavia, l’ottimizzazione di cocktail enzimatici adatti può ridurre l’utilizzo complessivo di enzimi durante la saccarizzazione di AFEX pretrattata biomassa39,40,41,42,43,44,45.41 Durante il pretrattamento dell’AFEX l’idrolisi e l’ammonolisi dei collegamenti di esteri porta alla formazione di acido e prodotti amide nella biomassa pretrattata (ad esempio, acido acetico/acetamide, acido ferullico/ferulamide, acido coumarico/coumarylamide)36. Anche se la formazione di amidi ha dimostrato di aiutare il processo di fermentazione, la loro presenza a concentrazioni molto elevate nelle materie di prima qualità pretratta potrebbe essere una preoccupazione se l’alimentazione degli animali pretrattasse i biomi. Per affrontare il problema è possibile utilizzare la pre-idrolisi dei collegamenti esteri con alcali come NaOH o Ca(OH)2 prima del pretrattamento AFEX.

Ci sono una serie di considerazioni di sicurezza da tenere a mente quando si lavora con l’ammoniaca anidisca durante il processo AFEX. L’ammoniaca idroelettrica reagisce con rame, ottone, alluminio, acciaio al carbonio e polimeri fluoroelastomeri comuni utilizzati nelle guarnizioni (ad esempio Viton, ecc.). Eventuali tubi o componenti del reattore che possono entrare in contatto con l’ammoniaca devono essere realizzati in acciaio inossidabile, mentre le guarnizioni, i sedili delle valvole e le guarnizioni a collegamento rapido devono essere prodotti da Teflon o Kalrez quando possibile. L’ammoniaca non è considerata una sostanza chimica tossica, ma è ancora pericolosa a causa delle sue proprietà igroscopiche e criogeniche. Si rivolge facilmente e può danneggiare gravemente le membrane mucose negli occhi e nel sistema respiratorio. L’ammoniaca è un fluido criogenico e le perdite di ammoniaca possono causare un forte congelamento a causa del contatto diretto con il flusso di gas o con le apparecchiature refrigerate. L’ammoniaca è immediatamente pericolosa per la vita e la salute (IDLH) a concentrazioni superiori a 300 ppm. I lavoratori devono evacuare immediatamente nel caso in cui la concentrazione superi i 50 ppm. Si raccomanda agli operatori di indossare un monitor di ammoniaca calibrato per avvertire di concentrazioni pericolose nelle loro vicinanze. Si consiglia inoltre di installare sensori con allarmi nell’area di lavoro principale. I lavoratori che maneggiano l’ammoniaca devono essere adeguatamente addestrati e indossare indumenti protettivi come respiratori di fuga dotati di cartucce di metilamina, guanti criogenici e protettivi termici e pronti a gestire situazioni di emergenza. In caso di esposizione all’ammoniaca idroelettrica, l’operatore deve spostarsi in sicurezza e scovare immediatamente l’area interessata con acqua per almeno 15 min. Il processo di pretrattamento dell’ammoniaca deve essere condotto all’interno di una cappa di fumi e il cilindro di ammoniaca deve essere conservato in una cappa di fumi o in un armadio ventilato. Dopo l’esperimento, la biomassa pretrattata avrà un po ‘di ammoniaca libera residua e dovrebbe essere essiccata nel cofano durante la notte o in una scatola di essiccazione ventilata personalizzata prima di immagazzinare in sacchetti di plastica a temperatura ambiente per gli esperimenti di follow-up. Alcune altre considerazioni chiave sulla sicurezza includono l’installazione di un sistema di erogazione dell’ammoniaca con un misuratore di flusso che contribuirà a fornire con precisione l’ammoniaca al reattore e un reattore progettato per gestire almeno 1,5 volte la pressione che il processo di pretrattamento subirà (ad esempio, per la gestione del processo AFEX a 2 x 106 Pa pressione, il livello di pressione minimo del reattore dovrebbe essere 3 x 106 Pa).

Il pretrattamento di AFEX è un metodo promettente per produrre biomassa vegetale altamente digeribile che può essere utilizzata direttamente come mangime per animali o come materia prima per generare combustibili e sostanze chimiche. Al di là di queste due industrie, AFEX potrebbe trovare l’uso in altri settori, come una materia prima bio-rinnovabile per la produzione di biomateriali, o come materia prima per la produzione di biogas. Il processo su scala di laboratorio può essere condotto in un laboratorio dotato di spazi ventilati adeguati e precauzioni di sicurezza, e il nostro lavoro attuale conferma che questo processo AFEX in scala ridotta mostra risultati simili al materiale generato in un reattore AFEX in scala e/o pilota. Il processo AFEX su scala di laboratorio può essere utilizzato per testare materie prime, condizioni di elaborazione e applicazioni in modo più elevato, fornendo al contempo una ragionevole aspettativa delle prestazioni del processo su scala pilota o industriale.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto in parte dal Great Lakes Bioenergy Research Center, U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research sotto Award Numbers DE-SC0018409 e DE-FC02-07ER64494. Rebecca Ong riconosce il supporto parziale della Michigan Technological University (finanziamento delle startup). Shishir Chundawat riconosce il supporto parziale del premio CBET della US National Science Foundation (1604421), dell’ORAU Ralph E. Powe Award e della Rutgers School of Engineering (Startup Funding). Bruce Dale riconosce il supporto parziale dell’ufficio Michigan State University AgBioResearch e dell’USDA National Institute of Food and Agriculture. Venkatesh Balan riconosce il sostegno parziale dello Stato del Texas e dell’Università di Houston (Startup Funding). I dipendenti MBI riconoscono il supporto parziale del Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti e della fondazione della Michigan State University. Infine, vorremmo dedicare questo documento al nostro mentore e co-autore, il professor Bruce Dale per averci ispirato a perseguire in modo collaborativo il nostro sogno di realizzare biocarburanti cellulosici sostenibili.

Materials

Safety Equipment/PPE
Ammonia Monitor CanarySense BW GAXT-A-DL Single gas detector, Ammonia (NH3), 0 to 100 ppm
Cryogenic gloves Amazon B01L8WA238/B01L8WA1H0/B01L8WA1O8 Keep hands protected when handling liquid ammonia
Ear muffs 3M H7A Ear muffs to protect hearing when releasing ammonia at end of pretreatment
Face shield – – Wear while handling ammonia
Heat protective gloves Grainger 2EWX1/2EWX2/2EWX3 Showa heat resistant gloves, max temperature 500°F
Nitrile gloves – – Wear while mixing biomass to prevent contamination
Reagents
Anhydrous Ammonia Compressed Gas Cylinder – – An anhydrous ammonia compressed gas cylinder with a dip tube is required for this process. The dip tube is essential in order to withdraw liquid ammonia from the cylinder.
Distilled water – – Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading
Milled or Chopped Corn Stover – – Corn stover is not readily commercially available. Contact local farmers or agricultural extension if you wish to locate some.
Nitrogen Compressed Gas Cylinder – –
Equipment
Ammonia Cylinder Adapter – – CGA fitting that depends on the gas cylinder. Matheson is a good source. Some require teflon gaskets. This connects the cylinder to the ammonia delivery system. A regulator is not necessary as the system uses liquid ammonia.
Ammonia Delivery System (Figure 4) Swagelok Misc. Stainless steel pressure cylinder and components, valves, check valves, and gauges were used for all lines potentially in contact with ammonia.
Analytical Balance Sartorius CPA4202S Balance used for preparing biomass and weighing the reactors. Toploading balance, 4200g x 0.01g
Chemraz O-rings Harvard Apparatus 5013091 Ammonia-resistant o-rings for the SS syringe
Custom Tubular Reactors (Figure 3) Parts were purchased from McMaster-Carr, Swagelok, Omega, and Motion Industries (Dixon Fittings) Misc. To be compatible with ammonia, the custom reactor was constructed from stainless steel components (sanitary tube and fittings, compression fittings, quick connect, pressure gauge, thermocouple), and teflon gaskets. The maximum pressure rating of the vessel is 1500 psig, which is the maximum pressure rating of the bolted sanitary clamps.
Drying Box – – Optional: an enclosed system for drying is necessary if planning to do microbial experiments to avoid contamination. Avoid drying at elevated temperatures.
High Pressure Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3311 Infuse/Withrdraw PHD ULTRA HPSI Programmable Syringe Pump for transferring liquid ammonia
Moisture Analyzer Sartorius MA35 Moisture analyzer for determining moisture content of biomass prior to pretreatment.
Nitrogen Delivery Misc. Misc. Nitrogen compressed gas cylinder, inert gas regulator (at least 1000 psig max pressure rating), lines, and valves.
Ratchet wrench and 7/8" socket – – Ratchet and socket to quickly tighten and open bolts on the sanitary clamp. Can be purchased anywhere.
Retractable Thermocouple Cables Omega RSC-K-3-4-5 Retractable thermocouple cable. You need one for each reactor.
Stainless Steel Syringe Harvard Apparatus 702261 Stainless steel syringe for tranferring ammonia to the reactors.
Temperature Monitor Omega HH12B Dual input temperature monitor. You need one for every two reactors.
Voltage Controller McMaster-Carr 6994K11 Variable-Voltage Transformer for controlling heating to the reactors. You need one for each reactor.
Supplies
Metal Scoops, Spoons and/or Spatulas – – For transferring biomass for weighing, mixing, transferring into the reactor and removing from the reactor at the end of the run
Plastic Bowls or Tubs – – Used for mixing the biomass with the water. Any bowl or tub could be used.
Spray Bottle – – Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading
Wide-Mouth Funnel – – Any funnel that has a bottom opening 0.5-1.0 inches diameter.
Wooden Dowel – – 1-1.5" diameter wooden dowel to assist with loading/unloading the reactor
Consumables
Glass Wool Sigma-Aldrich CLS3950-454G For packing the top of the reactor to prevent biomass escape and clogging the tubing
Plastic Press-to-Close Bags McMaster-Carr 1959T24 Bags for storing processed samples and for transferring to drying box
Plastic Tote – – Used to transfer pretreated biomass to an alternate location for drying
Plastic Weighboats or Metal Trays – – Used to catch the biomass when removing from the reactors, and for storing the samples while drying
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Chundawat, S. P. S., Pal, R. K., Zhao, C., Campbell, T., Teymouri, F., Videto, J., Nielson, C., Wieferich, B., Sousa, L., Dale, B. E., Balan, V., Chipkar, S., Aguado, J., Burke, E., Ong, R. G. Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass. J. Vis. Exp. (158), e57488, doi:10.3791/57488 (2020).
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