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Environment

Expansión de fibra de amoníaco (AFEX) Pretratamiento de biomasa lignocelulósica

Published: April 18, 2020
doi:
10.3791/57488
, , , , , , , , , , , , , ,
1Department of Chemical and Biochemical Engineering,Rutgers-State University of New Jersey, 2Michigan Biotechnology Institute (MBI), 3Department of Chemical Engineering and Materials Science,Michigan State University, 4Engineering Technology Department, Biotechnology Program, College of Technology,University of Houston, 5Department of Chemical Engineering,Michigan Technological University

Summary

La expansión de la fibra de amoníaco (AFEX) es una tecnología de pretratamiento termoquímica que puede convertir la biomasa lignocelulósica (por ejemplo, la tala de maíz, la pajita de arroz y la bagazo de caña de azúcar) en una materia prima altamente digerible tanto para biocombustibles como para aplicaciones de alimentación animal. Aquí, describimos un método a escala de laboratorio para llevar a cabo el pretratamiento AFEX en biomasa lignocelulósica.

Abstract

Los materiales lignocelulósicos son materias primas derivadas de plantas, como residuos de cultivos (por ejemplo, lapidadora de maíz, la paja de arroz y el bagazo de caña de azúcar) y cultivos energéticos cultivados específicamente (por ejemplo, miscanthus y pastos) que están disponibles en grandes cantidades para producir biocombustibles, bioquímicos y piensos para animales. Los polisacáridos vegetales (es decir, celulosa, hemicelulosa y pectina) incrustados dentro de las paredes celulares son altamente recalcitrantes hacia la conversión en productos útiles. La expansión de la fibra de amoníaco (AFEX) es un pretratamiento termoquímico que aumenta la accesibilidad de los polisacáridos a las enzimas para la hidrólisis en azúcares fermentables. Estos azúcares liberados se pueden convertir en combustibles y productos químicos en una biorrefinería. Aquí, describimos un proceso AFEX por lotes a escala de laboratorio para producir biomasa pretratada a escala de gramo sin ningún reciclaje de amoníaco. El proceso a escala de laboratorio se puede utilizar para identificar condiciones óptimas de pretratamiento (por ejemplo, carga de amoníaco, carga de agua, carga de biomasa, temperatura, presión, tiempo de residencia, etc.) y genera cantidades suficientes de muestras pretratadas para la caracterización fisicoquímica detallada y el análisis enzimático/microbiano. El rendimiento de los azúcares fermentables a partir de hidrólisis enzimática de la talatera de maíz pretratada mediante el proceso AFEX a escala de laboratorio es comparable al proceso AFEX a escala piloto en condiciones de pretratamiento similares. Este documento está destinado a proporcionar un procedimiento de funcionamiento estándar detallado para el funcionamiento seguro y consistente de reactores a escala de laboratorio para la realización de pretratamiento AFEX de biomasa lignocelulósica.

Introduction

La expansión de la fibra de amoníaco (AFEX) es un pretratamiento termoquímico que utiliza amoníaco volátil como principal reactivo para el pretratamiento de biomasa celulósica. Este proceso fue inventado originalmente por Bruce Dale para reducir de manera rentable la recalcitrancia de la biomasa lignocelulósica y mejorar la deconstrucción de biomasa pretratada catalizada biológicamente en azúcares fermentables1,,2. A diferencia de la mayoría de los otros pretratamientos termoquímicos a base acuosa3,AFEX es un proceso seco a seco que no causa ningún cambio significativo en la composición de la biomasa y no requiere ningún paso de lavado con su generación y gasto de residuos asociados. La recuperación del exceso de amoníaco volátil se ha demostrado a escala piloto, lo que reduce los costos de generación y procesamiento de residuos. El sistema de reactor AFEX de lecho envasado a escala piloto desarrollado por MBI(Figura 1) recupera el amoníaco residual mediante la extracción de vapor y transfiere el amoníaco caliente y concentrado a una nueva cama embalada4,5. Después del pretratamiento de AFEX, las pequeñas cantidades de nitrógeno incorporadas a la biomasa son utilizables como nitrógeno no proteico por animales y microorganismos rumiantes. Además, al alterar la ultraestructura de biomasa a través de diversos mecanismos fisicoquímicos6,7,8, AFEX aumenta la accesibilidad de la biomasa a las enzimas activas de carbohidratos (CAZymes) y aumenta las tasas de polisacáridos hidrólisis por varias veces8,9, que también aumenta su digestibilidad por animales rumiantes a través de su microbioma celulótico4,10,11.12 Los agricultores han empleado durante mucho tiempo una versión más sencilla de este método para aumentar la digestibilidad de los forrajes de rumiantes incubando la biomasa durante días o semanas bajo lonas plásticas en presencia de bajas cargas de amoníaco anhidro (<4% p/p de base de biomasa seca) y presiones y temperaturas ambientales10,,11.

El amoníaco anhidro fue investigado por primera vez por su potencial para detallar la madera en la década de 1950 y como un químico de pulpa a principios de 197013,14,15,16,17,18. A principios de la década de 1980, el amoníaco concentrado presurizado a alta temperatura (>30% NH4OH) en condiciones subcríticas se utilizó por primera vez en el laboratorio Dale para mejorar la digestibilidad enzimática y la fermentabilidad microbiana de la biomasa lignocelulósica19. Este proceso sufrió varios cambios de nombre a lo largo de los años, comenzando como explosión de congelación de amoníaco, y luego explosión de fibra de amoníaco, y finalmente, expansión de fibra de amoníaco, o simplemente AFEX. Alrededor de este mismo tiempo (a finales de la década de 1980), DuPont (ahora Dow-DuPont) también exploró utilizando procesos de pretratamiento a base de amoníaco anhidro supercríticos y casi críticos para aumentar la digestibilidad de la biomasa20,,21,,22. En las últimas décadas, se ha aumentado el énfasis en el uso de soluciones de amoníaco acuoso diluido como reactivo de pretratamiento, incluyendo el reciclaje/percolación de amoníaco23 (ARP), el remojo de amoníaco acuoso (SAA), o el proceso Dow-DuPont sin amoníaco reciclar24. Algunos métodos adicionales han analizado el uso de amoníaco anhidro (amoníaco anhidro de baja humedad (LMAA) y pretratamiento de amoníaco bajo en líquido25 (LAA). Recientemente se desarrollaron dos nuevas tecnologías avanzadas de pretratamiento de tipo organosolv que utilizan amoníaco anhidro líquido26,,27 y soluciones a base de amoníaco-sal28 a cargas de alto líquido a sólido según cargas sólidas que permiten fraccionamiento selectivo de lignina e hidrólisis enzimática de alta eficiencia de biomasa celulósica pretratada a cargas enzimáticas ultrabajas. Un artículo de revisión reciente ha puesto de relieve las similitudes y diferencias claras entre las diversas formas de pretratamiento a base de amoníaco29. Sin embargo, hasta hacepoco 4,no había demostraciones a escala piloto de procesos de pretratamiento a base de amoníaco (como AFEX) que se combinaran eficientemente con el reciclaje químico de bucle cerrado de amoníaco concentrado utilizado en el proceso.

En este artículo, describimos en detalle el protocolo AFEX más utilizado para pretratar la biomasa celulósica a escala de laboratorio para producir escalas de gramos de biomasa pretratada (por ejemplo, 1 a varios 100 g). Típicamente, la biomasa se mezcla con agua (0.1–2.0 g H2O/g biomasa seca) y se carga en un tubular de acero inoxidable hecho a medida o reactores de tipo Parr. A continuación, se añade amoníaco anhidro (0,3–2,0 g de biomasa seca NH3/g)al reactor y la mezcla se calienta a la temperatura de reacción deseada (60–180 oC). Publicaciones anteriores sobre el proceso AFEX de la década de 1980-1990 comenzaron el tiempo de residencia de pretratamiento (por ejemplo, 5-60 min) inmediatamente después de la rampa de temperatura. Sin embargo, como las reacciones se producen tan pronto como se añade el amoníaco al reactor, el procedimiento Actual de AFEX debe comenzar a controlar el tiempo de residencia inmediatamente después de la adición de amoníaco al reactor. Para temperaturas de 90 oC o superiores, a menudo es necesario precalentar la biomasa antes de cargar el amoníaco para mantener la temperatura inicial en rampa hasta un período de tiempo mínimo (es decir, <5 min). Al finalizar el tiempo de residencia, se abre una válvula para liberar rápidamente la presión y el contenido en fase de gas en una campana de humo súcto súcto súbdito súbdito químico adecuada. La rápida conversión de amoníaco de fase de líquido a gas también hace que el reactor se enfríe. Los reactores pequeños (100 ml de volumen del reactor) pueden necesitar tiempo adicional para enfriarse. Para la seguridad del usuario, a mayor escala (>100 g de amoníaco por reactor), se recomienda purgar con nitrógeno para eliminar la mayor cantidad de amoníaco residual posible del recipiente y ayudar a enfriar el contenido del reactor antes de descargar. Por lo general, no se hace ningún intento a escala de laboratorio para reciclar y / o recuperar el amoníaco. Uno de los principales desafíos de diseño para ampliar el proceso de pretratamiento de AFEX ha sido el reciclaje de amoníaco con un capital mínimo y costos operativos. Además, la adición de amoníaco líquido a la biomasa generalmente impulsa el parpadeo parcial del líquido que enfría la biomasa, lo que requiere calentamiento de la mezcla de biomasa y amoníaco antes de que pueda comenzar el tratamiento con AFEX. En lugar de añadir amoníaco como líquido, añadir vapor de amoníaco a la biomasa ofrece dos ventajas: en primer lugar, la alta porosidad de la biomasa a granel permite transportar rápidamente el vapor de amoníaco, lo que resulta incluso en la distribución de amoníaco a través de la biomasa. En segundo lugar, el vapor de amoníaco se disuelve fácily y exotérmicamente en el agua entrenada en biomasa húmeda, lo que resulta en una generación de calor que calienta rápida y uniformemente la biomasa. Para aprovechar estas ventajas, tanto el laboratorio MSU Dale como MBI han desarrollado métodos de tratamiento AFEX utilizando vapor de amoníaco. El laboratorio Dale ha desarrollado el proceso de Pretratamiento de Amoníaco Gaseoso (GAP)30,y MBI ha desarrollado el proceso de reactor AFEX de lecho embalado (Figura 1)4, que se ha demostrado a escala piloto. El sistema de reactor AFEX de lecho embalado es capaz de funcionar en modo semi-lote con un reciclaje completo de amoníaco utilizando un método de extracción de vapor4,5. Este novedoso proceso a escala piloto de MBI explota las características químicas y físicas del amoníaco para pretratar eficientemente la biomasa mientras se recicla eficientemente el amoníaco.

Aquí, presentamos un esquema detallado para la realización del pretratamiento AFEX de la talla de maíz a escala de laboratorio utilizando reactores tubulares de volumen de 200 ml personalizados(Figura 2). Las muestras pretratadas de AFEX se digerían en azúcares fermentables utilizando cócteles de enzimas celulósicas disponibles en el mismo para demostrar la eficacia de los procesos de pretratamiento. Los resultados de hidrólisis enzimática para el reactor AFEX a escala de laboratorio se compararon con muestras generadas por reactores AFEX a escala piloto más grandes. Nuestro objetivo es proporcionar un procedimiento operativo estándar para el funcionamiento seguro y consistente de reactores presurizados a escala de laboratorio para realizar el pretratamiento AFEX en biomasa celulósica como la estapida de maíz. En el archivo pdf complementario adjunto se destaca información adicional de apoyo sobre las variaciones de este proceso de pretratamiento AFEX a escala de laboratorio (por ejemplo, el proceso AFEX de cama empaquetada a escala piloto). Un informe detallado sobre los pasos operativos del proceso AFEX de la cama embalada se resaltará en una publicación separada y está disponible a petición de MBI-MSU.

Protocol

1. Ajuste del contenido de humedad de biomasa Consulte la Tabla de materiales que describe todos los equipos y materiales principales necesarios para realizar el pretratamiento AFEX a escala de banco o laboratorio utilizando el reactor tubular AFEX personalizado (Figura 2). Determinar el contenido total de humedad de la biomasa utilizando un analizador de humedad, o un horno a 105 oC durante 8 h. Para el método del horno, transfiera las muestras a un desecador resistente al calor para enfriar para evitar la adsorción de agua antes del secado. Realice el proceso duplicado o triplicado y calcule el contenido medio de humedad. Para una carga de biomasa seca determinada en el reactor (aquí, tiene 25 g), utilice el contenido de humedad determinado en el paso 1.2, para calcular cuánta biomasa húmeda necesita ser cargada.[1]Donde mhúmedo – masa total de biomasa (base de peso húmedo); mseco – masa de biomasa sobre una base de peso seco; MCTWB – Contenido de humedad de biomasa sobre una base de peso total Pesar esta cantidad de biomasa (mhúmedo)en un recipiente de plástico. Calcule cuánta agua debe mezclarse con la biomasa húmeda para lograr el contenido de humedad deseado. Para la trituradora de maíz, esto es típicamente 0,6 g de H2O por g de biomasa seca.[2]Donde magua – masa de agua añadida al reactor (además del agua en la biomasa); xagua – carga de agua AFEX (g:g biomasa seca) Usando una botella de spray, agregue lentamente esta cantidad de agua (magua)a la biomasa que se había pesado previamente y mezcle bien a mano. 2. Cargue y monte el reactor Montar el cuerpo del reactor colocando una tapa y una junta de teflón en la parte inferior del tubo del reactor. Atornillar una abrazadera en su lugar, apretando ambas tuercas uniformemente usando un rachet. Transfiera la biomasa húmeda a la base del reactor montada y coloque un tapón de lana de vidrio en la parte superior de la biomasa. Coloque una junta de teflón en la parte superior del reactor. Asegurar que la región esté libre de biomasa y lana de vidrio, lo que podría impedir un sello eficaz, y colocar la cabeza del reactor en la parte superior, maniobrando el termopar a través de la lana de vidrio y la biomasa. Perno la abrazadera en la parte superior del reactor usando un trinquete uniformemente en ambos lados. Pesar el reactor(reactorm) y registrar el peso. 3. Configure el sistema del reactor y llene el cilindro de transferencia de amoníaco Confirme que todo el equipo está enchufado y operable (controlador de temperatura, monitor de temperatura, bomba de jeringa, temporizadores). Ajuste los temporizadores al tiempo de residencia deseado para cada reactor y muestra que se ejecutará. Encienda y, si utiliza una bomba de jeringa programable, configure el método de administración de amoníaco en la bomba de jeringa.Paso 1: Retiro.Paso 2: Espere 15 segundos (para dejar tiempo para abrir y cerrar válvulas).Paso 3: Infundir (para transferir el amoníaco al reactor). Guardar como el método AFEX para permitir una fácil reutilización. Verifique que todas las válvulas dentro y fuera del pequeño cilindro de amoníaco estén cerradas. Si el cilindro se ha utilizado previamente y contiene amoníaco/nitrógeno residual, abra lentamente la válvula A en la parte superior del pequeño cilindro de amoníaco para desangrar cualquier nitrógeno y cerrar la válvula una vez que el amoníaco líquido comience a espuelar. Para llenar el pequeño cilindro de amoníaco, abra el gran cilindro de amoníaco anhidro y todas las válvulas de la línea de amoníaco. Abra lentamente la válvula (B) cerca de la parte superior del pequeño cilindro de amoníaco hasta que la presión se estabilice. Espere 5 minutos antes de continuar con el siguiente paso. Aproximadamente 120 ml de amoníaco se cargan desde el cilindro principal al cilindro de transferencia durante este tiempo. Cierre todas las válvulas entre el tanque de amoníaco y el pequeño cilindro de amoníaco, trabajando de izquierda a derecha, comenzando desde el pequeño cilindro (válvula B) y terminando en la válvula principal en la parte superior del tanque. Ajuste el regulador de nitrógeno a 350 psi. Abra la válvula del cilindro de nitrógeno y la válvula del regulador conectado. Abra la válvula C en el pequeño cilindro de amoníaco para añadir lentamente nitrógeno, presasegurando el sistema. Ajuste la presión del cilindro pequeño a 350 psi, según sea necesario, ajustando el punto de ajuste en el regulador. Mantenga las líneas de nitrógeno abiertas mientras dispensa amoníaco. 4. Precalentar el reactor (para temperaturas de reacción de >100 oC) Conecte el monitor de temperatura al termopar y la cinta de calentamiento al controlador de temperatura. Ajuste manualmente el controlador de temperatura para llevar el reactor a 60 oC. 5. Cargue el reactor con amoníaco Encienda la bomba de la jeringa si aún no está encendida. Calcule el volumen de amoníaco requerido en función de la carga de amoníaco deseada (g:g biomasa seca) y una calibración de amoníaco previamente determinada.[3]NOTA: Debido a que la bomba de amoníaco se carga sobre una base de volumen, cuando se utiliza por primera vez, calibrar para convertir de la masa requerida al volumen. Siga el mismo procedimiento utilizado para AFEX, pero termine la carrera (ventilar el reactor) inmediatamente después de cargar el amoníaco y pesar el reactor. Siga el mismo procedimiento para descargar el reactor. Configure el método para cargar la cantidad correcta de amoníaco: Seleccione el método AFEX en la sección 3.3. Prensa definición de pasos ( Step Definition) Paso: 1 Establezca Volumen o Hora de destino. Introduzca el volumen requerido en mL utilizando el teclado numérico y pulse la marca de verificación verde. Si se requieren más de 85 ml, introduzca el volumen objetivo como la mitad de la cantidad especificada en la hoja de cálculo y llene el reactor dos veces con el mismo volumen de jeringa. Repita los pasos 5.3.2 a 5.3.4 para “Paso: 3”. Pulse el botón Atrás. Abra la válvula (D) en la parte inferior del pequeño cilindro de amoníaco hacia el escape, y luego ciérrela una vez que haya salido el amoníaco residual. Abra la válvula (E) en el extremo de la bomba de la jeringa hacia la parte delantera de la campana de humos, y luego abra la válvula (F) para liberar cualquier amoníaco residual. Cierre las válvulas (E) y (F). Desconecte el reactor del monitor de temperatura y del controlador de temperatura. Conecte el reactor a la conexión rápida. Válvula abierta (D) hacia el pequeño cilindro de amoníaco y la válvula abierta (E) hacia el pequeño cilindro de amoníaco. Presione la flecha verde de la bomba para iniciar la secuencia y extraer amoníaco en la jeringa. Cuando la jeringa se detenga automáticamente durante el período de espera, gire la válvula de la jeringa (E) hacia el reactor y la válvula de entrada del reactor para que apunte hacia el vástago de conexión rápida.Después del retraso, la jeringa comenzará a infundir, deteniéndose automáticamente en el punto de ajuste. Si se requieren más de 85 ml de amoníaco, repita los pasos 5.7 a 5.9. Cierre la válvula del reactor y la válvula (D). Abra la válvula (F) para liberar el amoníaco residual de la jeringa y, a continuación, cierre la válvula (F) y cierre la válvula (E). Abra la válvula (D) hacia el escape y, a continuación, ciérrela una vez que quede el amoníaco residual. Usando guantes criogénicos, retire el reactor de la conexión rápida. Tenga cuidado con el posible aerosol de amoníaco. Utilice la línea de ventilación del tronco del elefante para ventilar el amoníaco liberado, si es necesario. Encienda el temporizador para el reactor apropiado. Pesar la unidad del reactor para verificar que se ha añadido el peso adecuado de amoníaco en función de los cálculos de la hoja de cálculo. 6. Comience a calentar y monitorice la reacción Conecte el monitor de temperatura al termopar y la cinta de calentamiento al controlador de temperatura. Registre la temperatura inicial y la presión del reactor después de la adición de amoníaco (el inicio del tiempo de residencia). Ajuste manualmente el controlador de temperatura para llevar el reactor a la temperatura establecida. El objetivo es alcanzar el punto de ajuste en <5 min. Registre la presión y la temperatura del reactor cada 3 minutos hasta el final del tiempo de residencia. Al final del tiempo de residencia, desconecte el reactor del controlador de temperatura y del termopar, retire el reactor del soporte y abra lentamente la válvula de liberación de bolas dentro de la campana de humos.NOTA: Use siempre un protector facial durante este paso. 7. Apague el sistema Después de permitir que el reactor se enfríe durante unos minutos, utilice una llave de trinquete para abrir las abrazaderas del reactor. Descargue la biomasa y la lana de vidrio del reactor dentro de una campana de humos. Con el fin de evitar la contaminación por el aire de la biomasa a medida que se evapora el amoníaco residual, es mejor secar dentro de una caja de secado cerrada dentro de un espacio ventilado. Limpie el reactor con agua destilada hasta que el agua esté limpia y deje que los reactores se sequen. Si aún está abierto, cierre todas las válvulas y conecten al cilindro de amoníaco. Cierre todas las válvulas en la línea de nitrógeno. Apague el controlador de temperatura, el monitor de temperatura, el equilibrio, la bomba de jeringa y el temporizador.ADVERTENCIA: Si planea realizar más reacciones, no es necesario ventilar el pequeño cilindro de amoníaco. Sin embargo, si no hay ningún plan para ejecutar más experimentos, por seguridad es mejor ventilar el pequeño cilindro en el capó al final del experimento. Al hacer esto, es importante dejar las válvulas abiertas ya que la liberación de amoníaco puede causar la formación de hielo que puede bloquear algunas líneas. A medida que las líneas se descongelan, se puede liberar amoníaco adicional. Asegúrese siempre de que la ventilación funcione mientras permite que el sistema se desahogue. Cualquier biomasa tratada con amoníaco, incluso si no está destinada a ser utilizada, debe secarse en la campana de humos durante la noche para permitir que el amoníaco residual se evapore. No se puede desechar inmediatamente en la basura.

Representative Results

Después del pretratamiento de AFEX, la biomasa es de color más oscuro, pero de lo contrario visualmente sin cambios(Figura 3). El proceso AFEX genera un material altamente digerible a una variedad de escalas además de la descrita en este protocolo. Aquí, pretratamos la misma muestra de la cerca del maíz en nuestro pequeño sistema de 200 ml, cama embalada, a escala de banco; un reactor Parr más grande de 5 galones, agitado; y el reactor piloto del MBI. Las condiciones utilizadas para los dos reactores más pequeños (es decir, escala de 200 ml y 5 galones) fueron de 1,0 g de NH3:g de biomasa seca, 0,6 g de biomasa seca H2O:g, durante 30 min a 100 o5 oC. AFEX4 a escala piloto se llevó a cabo en el mismo material a 0,6 g de NH3: g de biomasa seca, 0,6 g de H2O:g de biomasa seca, durante 30 min a 100 o5 oC. Los detalles relativos a los protocolos utilizados para llevar a cabo el pretratamiento AFEX a escalas más grandes se proporcionan en la información de apoyo (véase el archivo suplementario 1). Se han establecido los siguientes “Criterios de Control de Calidad” en función de la temperatura objetivo para el pretratamiento AFEX. Si después de alcanzar el punto de ajuste, la temperatura del reactor sale fuera de 10 oC desde el punto de ajuste, el experimento debe ser abortado. Si no se alcanza la temperatura objetivo (dentro de 5 oC) dentro de los 5 minutos después del bombeo de amoníaco, aborte el experimento. Además, la eficacia del pretratamiento para el proceso AFEX se puede probar utilizando cócteles de enzimas celulósicas para hidrolizar los polisacáridos accesibles en azúcares fermentables. Las muestras se hidrolizaron enzimáticamente durante 72 horas a un 6% de carga de glucano, pH 5,0, 50 oC y 250 rpm en una incubadora de agitación. Se empleó un cóctel comercial de enzimas consistente en 60% celulasa (CTec3):40% hemicelulasa (HTec3 o NS22246) sobre una base fija de carga total de proteínas cargada a 15 mg de enzima/g de glucano para todos los ensayos de saccharificación. Los resultados(Figura 4) demuestran que el pretratamiento de AFEX aumenta significativamente el rendimiento de los azúcares fermentables en todos los casos. Además, el rendimiento de hidrólisis de celulosa/xilan para la biomasa pretratada mediante el proceso AFEX a escala de laboratorio es comparable al reactor Parr de 5 galones más grande y al proceso AFEX de lecho embalado a escala piloto de MBI. Figura 1. Esquema esquemático de los pasos involucrados en la operación a escala piloto del reactor AFEX de MBI para pretratar la biomasa lignocelulósica totalmente integrada con el reciclaje eficiente de amoníaco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Esquemas de laboratorio a escala de laboratorio de A) sistema de administración de amoníaco y B) pequeño reactor de pretratamiento AFEX de 200 ml utilizado para realizar el proceso AFEX descrito en el protocolo de vídeo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3. La biomasa pretratada AFEX tiene una morfología bruta muy similar en comparación con la biomasa no tratada, además de ser de color ligeramente más oscuro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Aquí se muestran los rendimientos de glucosa y xilosa obtenidos después de 72 h de hidrólisis enzimática de 6% de la estatador de maíz tratado Con AFEX de carga de glucano. Todos los ensayos de saccharificación se llevaron a cabo por duplicado con los valores medios (m) aquí reportados. Las desviaciones estándar (1s) se notifican aquí como barras de error. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Archivo suplementario 1: Protocolos adicionales Haga clic aquí para descargar este archivo. Tabla suplementaria 1: Sistema de entrega de amoníaco y marco de puntal Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El protocolo AFEX describe cómo procesar materiales vegetales en presencia de amoníaco anhidro y agua a temperaturas elevadas para aumentar la digestibilidad del material de pretratamiento por enzimas celulósicas y/o microbios. AFEX es altamente eficaz en especies de monocot graminoides (por ejemplo, cortador de maíz, pasto de conmutación, miscanthus, paja de arroz, paja de trigo y bagazo de caña de azúcar) debido a la eficiencia del proceso para cortar los enlaces de éster que son naturalmente abundantes en estos materiales31. AFEX es mucho menos eficaz en biomasa derivada de dicots y gimnospermas (maderas duras, maderas blandas y forbs nativos)32,,33 debido a la menor proporción de enlaces de éster a base de lignina-carbohidrato. Sin embargo, cuando estos enlaces se introducen en las paredes celulares leñosas utilizando biotecnología vegetal, el proceso de pretratamiento de AFEX se vuelve mucho más eficaz34.

El escote de los enlaces de éster permite eliminar ciertos componentes de biomasa del material, pero redepositados como extractivos en las superficies de la pared celular exterior, lo que resulta en la formación de agujeros a nanoescala que facilitan la penetración y la acción de las enzimas celulósicas6. La estatador de maíz pretratada por AFEX mostró un aumento de aproximadamente 3 veces en la tasa de liberación de glucosa y xilosa después de la hidrólisis enzimática en condiciones de sólidos altos en comparación con el material no tratado. Los pretratamientos de amoníaco también producen menos y mucho menos productos de degradación inhibitoria en comparación con el pretratamiento de ácido diluido35. Una comparación previa de AFEX y la trituradora de maíz tratada con ácido diluido mostró que el pretratamiento ácido diluido produce 316% más ácidos, 142% más aromáticos y 3,555% más de aldehídos furán que AFEX36,todos los cuales pueden ser inhibitorios para microorganismos35,37. Como AFEX es un proceso seco a seco, tampoco hay pérdida de azúcares como un flujo líquido diluido que no se puede utilizar económicamente durante la hidrólisis enzimática. Sin embargo, esto conduce a complicaciones como enzimas con la capacidad degradante de la celulosa y la capacidad degradante de la hemicelulosa son necesarias para descomponer completamente los polisacáridos de la pared celular durante la hidrólisis enzimática en azúcares fermentables mixtos como la glucosa y la xilosa. Los oligómeros hemicelululosicos se han divulgado para inhibir la actividad de la celulasa38, que podría requerir una mayor carga enzimática para mantener un alto rendimiento final de azúcar. Sin embargo, la optimización de cócteles enzimáticos adecuados puede reducir el uso general de enzimas durante la saccharificación de la biomasa pretratada AFEX39,40,41,42,43,44,45. Durante el proceso de pretratamiento a AFEX, la hidrólisis y la ammonólisis de los enlaces de éster conducen a la formación de ácidos y productos de amida en la biomasa pretratada (por ejemplo, ácido acético/acetamida, ácido ferúlico/ferulamida, ácido coumaric/coumarylamida)36. Aunque se ha demostrado que la formación de amidas ayuda al proceso de fermentación, su presencia a concentraciones muy altas en materia de materia prima pretratada podría ser una preocupación si alimentar a los animales con biomasa pretratada. La prehidrolisis de los enlaces de éster con álcalis como NaOH o Ca(OH)2 antes del pretratamiento a AFEX se puede utilizar para abordar el problema.

Hay una serie de consideraciones de seguridad a tener en cuenta cuando se trabaja con amoníaco anhidro durante el proceso AFEX. El amoníaco anhidro reacciona con cobre, latón, aluminio, acero al carbono y polímeros fluoroelastómeros comunes utilizados en sellos (por ejemplo, Viton, etc.). Cualquier tubo o componente del reactor que pueda entrar en contacto con el amoníaco debe estar hecho de acero inoxidable, y las juntas, asientos de válvulas y sellos de conexión rápida deben estar hechos de Teflón o Kalrez cuando sea posible. El amoníaco no se considera un producto químico tóxico, pero sigue siendo peligroso debido a sus propiedades higroscópicas y criogénicas. Se dirige fácilmente y puede dañar gravemente las membranas mucosas en los ojos y el sistema respiratorio. El amoníaco es un líquido criogénico y las fugas de amoníaco pueden causar una congelación grave debido al contacto directo con la corriente de gas o el equipo refrigerado. El amoníaco es inmediatamente peligroso para la vida y la salud (IDLH) a concentraciones superiores a 300 ppm. Los trabajadores deben evacuar inmediatamente en caso de que la concentración supere las 50 ppm. Se recomienda que los operadores lleven un monitor de amoníaco calibrado para advertir de las concentraciones peligrosas en sus proximidades. También es aconsejable instalar sensores con alarmas en el área de trabajo principal. Los trabajadores que manipulan amoníaco deben estar debidamente capacitados y usar equipo de protección, como respiradores de escape equipados con cartuchos de metilamina, guantes criogénicos y de protección térmica, y estar preparados para manejar situaciones de emergencia. En caso de exposición al amoníaco anhidro, el operador debe ponerse a salvo y lavar inmediatamente la zona afectada con agua durante al menos 15 minutos. El proceso de pretratamiento de amoníaco debe llevarse a cabo dentro de una campana de humo, y el cilindro de amoníaco debe almacenarse en una campana de humo o en un armario ventilado. Después del experimento, la biomasa pretratada tendrá algo de amoníaco libre residual y debe secarse en la campana durante la noche o en una caja de secado ventilada a medida antes de almacenarla en bolsas de plástico a temperatura ambiente para experimentos de seguimiento. Algunas otras consideraciones clave de seguridad incluyen la instalación de un sistema de administración de amoníaco con un medidor de flujo que ayudará a entregar con precisión el amoníaco al reactor y un reactor diseñado para manejar al menos 1,5 veces la presión que sufrirá el proceso de pretratamiento (por ejemplo, para manipular el proceso AFEX a presión de 2 x 106 Pa, la presión mínima del reactor debe ser de 3 x 106 Pa).

El pretratamiento AFEX es un método prometedor para producir biomasa vegetal altamente digerible que se puede utilizar directamente como alimento para animales o como materia prima para generar combustibles y productos químicos. Más allá de estas dos industrias, AFEX podría encontrar uso en otras áreas, como una materia prima bio-renovable para la fabricación de biomateriales, o como materia prima para la producción de biogás. El proceso a escala de laboratorio se puede llevar a cabo en un laboratorio equipado con el espacio ventilado adecuado y las precauciones de seguridad, y nuestro trabajo actual confirma que este proceso AFEX ampliado muestra resultados similares al material generado en un reactor AFEX piloto y/o escalado. El proceso AFEX a escala de laboratorio se puede utilizar para probar materias primas, condiciones de procesamiento y aplicaciones de una manera de mayor rendimiento, al tiempo que proporciona una expectativa razonable de cómo funcionaría el proceso a escalas piloto o industriales.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este material se basa en el trabajo apoyado en parte por el Centro de Investigación en Bioenergía de los Grandes Lagos, el Departamento de Energía de los Estados Unidos, la Oficina de Ciencia, la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental bajo los Números de Premio DE-SC0018409 y DE-FC02-07ER64494. Rebecca Ong reconoce el apoyo parcial de la Universidad Tecnológica de Michigan (financiación de startups). Shishir Chundawat reconoce el apoyo parcial del premio CBET de la Fundación Nacional de Cienciade los Estados Unidos (1604421), el Premio ORAU Ralph E. Powe y la Escuela de Ingeniería Rutgers (Startup Funding). Bruce Dale reconoce el apoyo parcial de la oficina de AgBioResearch de la Universidad Estatal de Michigan y también del Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA. Venkatesh Balan reconoce el apoyo parcial del Estado de Texas y la Universidad de Houston (Startup Funding). Los empleados de MBI reconocen el apoyo parcial del Departamento de Energía de los Estados Unidos y la fundación de la Universidad Estatal de Michigan. Por último, nos gustaría dedicar este artículo a nuestro mentor y coautor Prof. Bruce Dale por inspirarnos a perseguir de forma colaborativa nuestro sueño de fabricar biocombustibles celulósicos sostenibles.

Materials

Safety Equipment/PPE
Ammonia Monitor CanarySense BW GAXT-A-DL Single gas detector, Ammonia (NH3), 0 to 100 ppm
Cryogenic gloves Amazon B01L8WA238/B01L8WA1H0/B01L8WA1O8 Keep hands protected when handling liquid ammonia
Ear muffs 3M H7A Ear muffs to protect hearing when releasing ammonia at end of pretreatment
Face shield – – Wear while handling ammonia
Heat protective gloves Grainger 2EWX1/2EWX2/2EWX3 Showa heat resistant gloves, max temperature 500°F
Nitrile gloves – – Wear while mixing biomass to prevent contamination
Reagents
Anhydrous Ammonia Compressed Gas Cylinder – – An anhydrous ammonia compressed gas cylinder with a dip tube is required for this process. The dip tube is essential in order to withdraw liquid ammonia from the cylinder.
Distilled water – – Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading
Milled or Chopped Corn Stover – – Corn stover is not readily commercially available. Contact local farmers or agricultural extension if you wish to locate some.
Nitrogen Compressed Gas Cylinder – –
Equipment
Ammonia Cylinder Adapter – – CGA fitting that depends on the gas cylinder. Matheson is a good source. Some require teflon gaskets. This connects the cylinder to the ammonia delivery system. A regulator is not necessary as the system uses liquid ammonia.
Ammonia Delivery System (Figure 4) Swagelok Misc. Stainless steel pressure cylinder and components, valves, check valves, and gauges were used for all lines potentially in contact with ammonia.
Analytical Balance Sartorius CPA4202S Balance used for preparing biomass and weighing the reactors. Toploading balance, 4200g x 0.01g
Chemraz O-rings Harvard Apparatus 5013091 Ammonia-resistant o-rings for the SS syringe
Custom Tubular Reactors (Figure 3) Parts were purchased from McMaster-Carr, Swagelok, Omega, and Motion Industries (Dixon Fittings) Misc. To be compatible with ammonia, the custom reactor was constructed from stainless steel components (sanitary tube and fittings, compression fittings, quick connect, pressure gauge, thermocouple), and teflon gaskets. The maximum pressure rating of the vessel is 1500 psig, which is the maximum pressure rating of the bolted sanitary clamps.
Drying Box – – Optional: an enclosed system for drying is necessary if planning to do microbial experiments to avoid contamination. Avoid drying at elevated temperatures.
High Pressure Syringe Pump Harvard Apparatus 70-3311 Infuse/Withrdraw PHD ULTRA HPSI Programmable Syringe Pump for transferring liquid ammonia
Moisture Analyzer Sartorius MA35 Moisture analyzer for determining moisture content of biomass prior to pretreatment.
Nitrogen Delivery Misc. Misc. Nitrogen compressed gas cylinder, inert gas regulator (at least 1000 psig max pressure rating), lines, and valves.
Ratchet wrench and 7/8" socket – – Ratchet and socket to quickly tighten and open bolts on the sanitary clamp. Can be purchased anywhere.
Retractable Thermocouple Cables Omega RSC-K-3-4-5 Retractable thermocouple cable. You need one for each reactor.
Stainless Steel Syringe Harvard Apparatus 702261 Stainless steel syringe for tranferring ammonia to the reactors.
Temperature Monitor Omega HH12B Dual input temperature monitor. You need one for every two reactors.
Voltage Controller McMaster-Carr 6994K11 Variable-Voltage Transformer for controlling heating to the reactors. You need one for each reactor.
Supplies
Metal Scoops, Spoons and/or Spatulas – – For transferring biomass for weighing, mixing, transferring into the reactor and removing from the reactor at the end of the run
Plastic Bowls or Tubs – – Used for mixing the biomass with the water. Any bowl or tub could be used.
Spray Bottle – – Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading
Wide-Mouth Funnel – – Any funnel that has a bottom opening 0.5-1.0 inches diameter.
Wooden Dowel – – 1-1.5" diameter wooden dowel to assist with loading/unloading the reactor
Consumables
Glass Wool Sigma-Aldrich CLS3950-454G For packing the top of the reactor to prevent biomass escape and clogging the tubing
Plastic Press-to-Close Bags McMaster-Carr 1959T24 Bags for storing processed samples and for transferring to drying box
Plastic Tote – – Used to transfer pretreated biomass to an alternate location for drying
Plastic Weighboats or Metal Trays – – Used to catch the biomass when removing from the reactors, and for storing the samples while drying
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References

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Chundawat, S. P. S., Pal, R. K., Zhao, C., Campbell, T., Teymouri, F., Videto, J., Nielson, C., Wieferich, B., Sousa, L., Dale, B. E., Balan, V., Chipkar, S., Aguado, J., Burke, E., Ong, R. G. Ammonia Fiber Expansion (AFEX) Pretreatment of Lignocellulosic Biomass. J. Vis. Exp. (158), e57488, doi:10.3791/57488 (2020).
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