Адаптация 3' Быстрая амплификация CDNA заканчивается для сопоставления стенограммы в раке

Формирование 3′ конца является важнейшим шагом в мРНК созревания, который включает расщепления пре мРНК вниз по течению ПА с последующим добавлением ~ 250 untemplated adenines, которые составляют^1,хвост poly(A)². Poly(A) привязки белка (РАВР) связывается с poly(A) хвост, и это защищает мРНК Стенограмма от деградации и облегчает перевод¹.

Текущие оценки показывают, что 70% генов человека несколько перевал и таким образом пройти альтернативный сплайсингу, что приводит к несколько 3′ конца³. Таким образом важно определить, где хвост poly(A) придает остальной части 3′ УТР, а так же определить PAS, используемые любой данной транскрипт. С появлением следующего поколения секвенирования привело к одновременной идентификации 3′ необычных и перевал тысяч генов. Это увеличение возможности виртуализации требуется разработка bioinformatic алгоритмов для анализа данных, связанных с альтернативными сплайсингу 3′ конца. Для обнаружения de novo или проверки системы служебной аттестации и следовательно сопоставления 3′ конца отдельных генов из последовательности данных большого объема 3′ гонки остается метод выбора^4,5. Последовательностей, обычно включаются в cDNA продукции 3′ РАСЫ включают только часть 3′ УТР, содержащий poly(A) хвост, на сайте расщепления, ССА и последовательности вверх по течению ССА. В отличие от PCR, который требует разработки и использования конкретных прямого и обратного праймеров гена, 3′ гонка требует только два гена конкретных вложенных вперед грунтовки. Следовательно PCR требует более детального знания нуклеотидной последовательности гена, усиленные^4,6большого региона. С 3′ гонка использует то же обратный грунтовка, что цели, poly(A) хвост для всех polyadenylated РНК стенограммы, только вперед грунтовки должны быть ген конкретные, таким образом, только требует знания значительно меньше региона мРНК. Это позволяет амплификацию регионов, чьи последовательности не являются полностью характеризуется^4,7. Это позволило 3′ гонки использоваться не только для определения 3′ конца гена, но также определить и охарактеризовать крупных регионах вверх по течению ССА, которые составляют значительную часть 3′ УТР. Объединив 5′ гонки с модифицированных 3′ раса, которая включает в себя большие части 3′ УТР и фланкируя регионов, можно полностью последовательности или клонировать весь мРНК Стенограмма от 5′ конца его 3′ конца⁸.

Пример этого применения модифицированных 3′ гонка является недавнее идентификация Роман CCND1-MRCK фьюжн гена Стенограмма от линии Мантия клеточная лимфома клетки и больных раком. 3′ УТР состояла из последовательностей из как CCND1 , так и MRCK генов и был непокорным Мирна правила⁹. Два вложенных CCND1 конкретных вперед грунтовки дополняют региона непосредственно прилегающих и вниз по течению от CCND1 остановки кодон. Хотя весь транскриптом последовательности вместе с конкретными bioinformatic инструменты могут использоваться для обнаружения гена сплавливания в течение 3′ УТР¹⁰, многие лаборатории могут не хватает финансовых ресурсов или bioinformatic опыт, чтобы сделать использование этой технологии. Следовательно 3′ гонка является альтернативой для de novo идентификации и проверки Роман фьюжн генов, связанных с 3′ УТР. Учитывая резкое увеличение числа зарегистрированных фьюжн генов, а также прочитать транскрипты, 3′ гонка стала мощным инструментом в характеристике генных последовательностей^11,12. Кроме того недавние исследования показали, что различные последовательности в течение 3′ УТР, а также длина 3′ УТР может повлиять на стенограмму стабильность мРНК, локализации, переводимости и функции¹³. Отчасти объясняется повышенный интерес в сопоставлении транскриптом, наблюдается увеличение числа различных ДНК-полимеразы, разрабатываются для использования в лаборатории. Важно определить, какие типы изменений можно внести 3′ гонка протокола для того, чтобы использовать доступные репертуар полимераз.

Эта работа, доклады адаптации 3′ гонки на карте всего 3′ УТР, PAS и 3′ конца расщепления сайт ANKHD1 транскрипт с помощью вложенных грунтовки в рамках секции ANKHD1 транскрипт и два разных полимераз.