Summary

Адаптация 3' Быстрая амплификация CDNA заканчивается для сопоставления стенограммы в раке

Published: March 28, 2018
doi:

Summary

Два разных 3′ быстрого амплификация cDNA концы (3′ гонки) протоколы описанных здесь делают использование двух разных ДНК полимеразы для сопоставления последовательности, которые включают сегмент кадр открытом чтения (ORF), стоп-кодон, и всего 3′ УТР Стенограмма с помощью РНК полученные от разных рак клеточных линий.

Abstract

Созревание эукариотические мРНК включает в себя 3′ конца образование, которое включает в себя добавление poly(A) хвост. Для того, чтобы карта 3′ конца гена, традиционным методом выбора является 3′ быстрого амплификация cDNA концы (3′ гонки). Протоколы для 3′ гонки требуют тщательного проектирования и выбора вложенных грунтовки в течение 3′ непереведенные региона (3′ УТР) целевого гена интереса. Однако с несколькими изменениями протокол может использоваться для включения всего 3′ УТР и последовательности в рамках открытого чтение (ORF), обеспечивая более полное представление о взаимосвязи между ОРФ и 3′ УТР. Это в дополнение к идентификации сплайсингу сигнала (ССА), а также на сайте расщепления и сплайсингу, предоставляемый обычных 3′ гонки. Расширенный 3′ РАСЫ может обнаружить необычные 3′ необычных, включая гена сплавливания в течение 3′ УТР, и последовательность информация может использоваться для прогнозирования потенциальных Мирна привязки сайтов, а также AU богатые дестабилизирующих элементов, которые могут повлиять на стабильность транскрипт.

Introduction

Формирование 3′ конца является важнейшим шагом в мРНК созревания, который включает расщепления пре мРНК вниз по течению ПА с последующим добавлением ~ 250 untemplated adenines, которые составляют1,хвост poly(A)2. Poly(A) привязки белка (РАВР) связывается с poly(A) хвост, и это защищает мРНК Стенограмма от деградации и облегчает перевод1.

Текущие оценки показывают, что 70% генов человека несколько перевал и таким образом пройти альтернативный сплайсингу, что приводит к несколько 3′ конца3. Таким образом важно определить, где хвост poly(A) придает остальной части 3′ УТР, а так же определить PAS, используемые любой данной транскрипт. С появлением следующего поколения секвенирования привело к одновременной идентификации 3′ необычных и перевал тысяч генов. Это увеличение возможности виртуализации требуется разработка bioinformatic алгоритмов для анализа данных, связанных с альтернативными сплайсингу 3′ конца. Для обнаружения de novo или проверки системы служебной аттестации и следовательно сопоставления 3′ конца отдельных генов из последовательности данных большого объема 3′ гонки остается метод выбора4,5. Последовательностей, обычно включаются в cDNA продукции 3′ РАСЫ включают только часть 3′ УТР, содержащий poly(A) хвост, на сайте расщепления, ССА и последовательности вверх по течению ССА. В отличие от PCR, который требует разработки и использования конкретных прямого и обратного праймеров гена, 3′ гонка требует только два гена конкретных вложенных вперед грунтовки. Следовательно PCR требует более детального знания нуклеотидной последовательности гена, усиленные4,6большого региона. С 3′ гонка использует то же обратный грунтовка, что цели, poly(A) хвост для всех polyadenylated РНК стенограммы, только вперед грунтовки должны быть ген конкретные, таким образом, только требует знания значительно меньше региона мРНК. Это позволяет амплификацию регионов, чьи последовательности не являются полностью характеризуется4,7. Это позволило 3′ гонки использоваться не только для определения 3′ конца гена, но также определить и охарактеризовать крупных регионах вверх по течению ССА, которые составляют значительную часть 3′ УТР. Объединив 5′ гонки с модифицированных 3′ раса, которая включает в себя большие части 3′ УТР и фланкируя регионов, можно полностью последовательности или клонировать весь мРНК Стенограмма от 5′ конца его 3′ конца8.

Пример этого применения модифицированных 3′ гонка является недавнее идентификация Роман CCND1-MRCK фьюжн гена Стенограмма от линии Мантия клеточная лимфома клетки и больных раком. 3′ УТР состояла из последовательностей из как CCND1 , так и MRCK генов и был непокорным Мирна правила9. Два вложенных CCND1 конкретных вперед грунтовки дополняют региона непосредственно прилегающих и вниз по течению от CCND1 остановки кодон. Хотя весь транскриптом последовательности вместе с конкретными bioinformatic инструменты могут использоваться для обнаружения гена сплавливания в течение 3′ УТР10, многие лаборатории могут не хватает финансовых ресурсов или bioinformatic опыт, чтобы сделать использование этой технологии. Следовательно 3′ гонка является альтернативой для de novo идентификации и проверки Роман фьюжн генов, связанных с 3′ УТР. Учитывая резкое увеличение числа зарегистрированных фьюжн генов, а также прочитать транскрипты, 3′ гонка стала мощным инструментом в характеристике генных последовательностей11,12. Кроме того недавние исследования показали, что различные последовательности в течение 3′ УТР, а также длина 3′ УТР может повлиять на стенограмму стабильность мРНК, локализации, переводимости и функции13. Отчасти объясняется повышенный интерес в сопоставлении транскриптом, наблюдается увеличение числа различных ДНК-полимеразы, разрабатываются для использования в лаборатории. Важно определить, какие типы изменений можно внести 3′ гонка протокола для того, чтобы использовать доступные репертуар полимераз.

Эта работа, доклады адаптации 3′ гонки на карте всего 3′ УТР, PAS и 3′ конца расщепления сайт ANKHD1 транскрипт с помощью вложенных грунтовки в рамках секции ANKHD1 транскрипт и два разных полимераз.

Protocol

Носите пальто лаборатории, перчатки и защитные очки во все времена во время выполнения всех процедур в этом протоколе. Убедитесь, что контейнеры/пробирки, содержащие фенол и гуанидина реагент Изотиоцианаты открыт только в сертифицированных капот и утилизации отходов фенола в указанны…

Representative Results

Поиск вложенных вперед грунтовка: Гель агарозы от Рисунок 1 показывает два отдельных продуктов ПЦР гель (дорожки 1 и 2), которые используют то же вперед грунтовка, но разные обратный грунтовки. Майна 3 имеет собстве…

Discussion

Несмотря на появление массивной параллельной последовательности технологий, на основе гена в геном, 3′ гонки по-прежнему остается наиболее простой и экономичный метод для идентификации PAS и нуклеотидов, прилегающих к poly(A) хвост. Адаптация, описанные здесь расширяется с помощью 3′ гонки к…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы признать Bettine Gibbs за ее техническую помощь.

Materials

HeLa cells ATCC CCL-2 Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cells ATCC CRL-3006 Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cells DSMZ ACC-342 Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich F6178 Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/Streptomycin ThermoFisherScientific 15140122 Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlue Ambion AM9545 Coprecipitant.
DMEM ThermoFisherScientific 10569044 Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-Water ThermoFisherScientific AM9938 Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Solution Corning 21-030 1X PBS.
Chloroform Sigma  Aldrich C7559-5VL
2-propanol Sigma Aldrich I9516
Reagent Alcohol Sigma Aldrich 793175 Ethanol
Ethidium Bromide solution Sigma Aldrich E1510
TRIzol Reagent ThermoFisherScientific 15596026 Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master Mix Amresco N867 2X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTP Amresco N557
RQ1 RNase-Free DNase Promega M6101 Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X) New England BioLabs B7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF buffer ThermoFisherScientific F531S 2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymerase Agilent Technologies 600670 Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fischer K1691 Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder 5 Prime 2500360 Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III Alpha Innotech Used to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight Ladder New England BioLabs N3233L Molecular weight DNA ladder.
Vortex Mixer MidSci VM-3200
Mini Centrifuge MidSci C1008-R
Dry Bath MidSci DB-D1
NanoDrop 2000C ThermoFisherScientific ND-2000C Spectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System BioRad 1704469 Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power Supply BioRad 1645050 Power supply for gel electrophoresis.
Agarose Dot Scientific AGLE-500
Mastercycler Gradient Eppendorf 950000015 PCR thermocycler.
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Centrifuge Eppendorf 5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up System Promega A9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cells ThermoFisherScientific K280020
MyPCR Preparation Station Mystaire MidSci MY-PCR24 Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hood ThermoFisherScientific Fume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle Counter Beckman Coulter 6605698 Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0 Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific) Software to analyze Sanger sequencing data.

References

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3′-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3′ end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D., White, B. A. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. 67, 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A., Freeman, L. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5′ and 3′ RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1027, 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284 (2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3’UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565 (2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846 (2014).

Play Video

Cite This Article
Masamha, C. P., Todd, Z. Adapting 3′ Rapid Amplification of CDNA Ends to Map Transcripts in Cancer. J. Vis. Exp. (133), e57318, doi:10.3791/57318 (2018).

View Video