Aanpassing 3' de snelle versterking van CDNA uiteinden kaart afschriften bij kanker

De vorming van de 3′-eind is een cruciale stap in de maturatie van mRNA dat bestaat uit het splijten van de pre-mRNA stroomafwaarts van een PAS gevolgd door de toevoeging van ~ 250 untemplated adenines, waaruit de poly(A) staart^1,2. De poly(A)-bindend-proteïne (PABP) bindt aan de staart van de poly(A), en dat de transcriptie van mRNA beschermt tegen afbraak, en vergemakkelijkt vertaling¹.

Huidige schattingen blijkt dat 70% van menselijke genen meerdere PASs hebben, en dus het ondergaan van alternatieve polyadenylatie, wat resulteert in meerdere 3′ einden³. Het is dus belangrijk om te identificeren waar de poly(A) staart hecht aan de rest van de 3′ UTR, evenals het identificeren van de PAS gebruikt door een bepaald afschrift. De komst van de volgende generatie sequencing heeft geleid tot de gelijktijdige identificatie van de 3′ UTRs en de PASs van duizenden genen. Deze toename van sequencing mogelijkheden heeft de ontwikkeling van bioinformatic algoritmen voor het analyseren van gegevens met betrekking tot alternatieve polyadenylatie van de 3′-eind vereist. Voor de detectie van DOVO of validering van de PAS en vandaar in kaart brengen van 3′ eind van afzonderlijke genen van grootschalige sequencing gegevens, blijft 3′ RACE de methode van keuze^4,5. De sequenties die zijn opgenomen in de cDNA producten van 3′ RACE normaal bevatten slechts een gedeelte van de 3′ UTR waarin de poly(A) staart, de breukzijde, de PAS en de sequenties stroomopwaarts van de PAS. In tegenstelling tot de PCR, waarvoor het ontwerp en gebruik van gene specifieke voorwaartse en omgekeerde inleidingen, vereist 3′ RACE alleen twee gene specifieke geneste voorwaartse primers. Vandaar, PCR vereist een meer gedetailleerde kennis van de nucleotide-volgorde van een groot gebied van het gen wordt versterkte^4,6. Aangezien 3′ RACE gebruikt keren hetzelfde primer dat doelstellingen de poly(A) staart voor alle polyadenylated RNA afschriften, alleen de voorwaartse inleidingen moeten gene specifieke, dus alleen vereist kennis van een aanzienlijk kleinere regio van het mRNA. Hierdoor is de versterking van de regio’s waarvan sequenties niet volledig gekenmerkt^{4,7 zijn}. Dit heeft toegestaan 3′ RACE worden gebruikt niet alleen om te bepalen van de 3′-eind van een gen, maar om ook bepalen en karakteriseren van grote gebieden stroomopwaarts van de PAS die een aanzienlijk deel van de 3′ UTR vormen. Door het combineren van 5′ RACE met de gewijzigde 3′ RACE die grotere porties van de 3′ UTR en flankerende gebieden omvat, is het mogelijk om volledig volgnummer of kloon van een hele mRNA transcriptie van het einde 5′ aan de 3′-eind⁸.

Een voorbeeld van deze toepassing van gemodificeerde 3′ RACE is de recente identificatie van een roman CCND1-MRCK fusion gene transcriptie van mantel cel lymfoom cellijnen en kankerpatiënten. De 3′ UTR bestond uit sequenties van genen van zowel de CCND1 als MRCK en was recalcitrante aan miRNA voorschrift⁹. De twee geneste CCND1 specifieke voorwaartse primers zijn complementair aan de regio onmiddellijk aangrenzende en “downstream” van de CCND1 stop codon. Hoewel de hele transcriptoom sequentie samen met specifieke bioinformatic hulpmiddelen kan worden gebruikt voor het detecteren van gene fusies binnen de 3′-UTR¹⁰, vele labs kunnen onvoldoende financiële middelen of bioinformatic deskundigheid om te maken gebruik van deze technologie. Vandaar, 3′ RACE is een alternatief voor DOVO identificatie en validatie van nieuwe fusion genen met betrekking tot de 3′ UTR. Gezien de drastische toename van het aantal gerapporteerde fusion genen, alsmede afschriften doorlezen, 3′ RACE uitgegroeid tot een krachtig instrument in het karakteriseren van gen-sequenties^11,12. Daarnaast hebben recente studies aangetoond dat verschillende reeksen binnen de 3′ UTR, evenals de lengte van de 3′ UTR kan invloed hebben op mRNA transcript stabiliteit, lokalisatie, vertaalbaarheid en functie¹³. Gedeeltelijk het gevolg van een verhoogde belangstelling voor in kaart brengen van de transcriptome, is er een toename van het aantal verschillende polymerase van DNA wordt ontwikkeld voor gebruik in het lab. Het is belangrijk om te bepalen wat typen wijzigingen kunnen worden aangebracht in de 3′ wedstrijdprotocol in om te gebruiken het beschikbare repertoire van de polymerase van DNA.

Dit werk verslagen aanpassing 3′ RAS om de gehele 3′ UTR in kaart, de PAS, en de 3′ eind breukzijde van het afschrift van de ANKHD1 met behulp van geneste inleidingen binnen de ANKHD1 afdeling van de chat-kopie en twee verschillende DNA-polymerase.