Adaptación de 3' amplificación rápida del CDNA termina para asignar las transcripciones en el cáncer

La formación del extremo 3′ es un paso crítico en la maduración del ARNm que comprende el clivaje del pre-mRNA aguas abajo de un paso seguido por la adición de 250 untemplated adenines, que forman parte de la cola de poly(A)^1,2. La proteína poly(A) (PABP) se une a la cola de poly(A), y este protege la transcripción del mRNA de la degradación y facilita la traducción¹.

Las estimaciones actuales sugieren que el 70% de genes humanos tiene PASs múltiples y así experimentar la poliadenilación alternativa, resultando en múltiples 3′ extremos³. Por lo tanto, es importante identificar donde la cola de poly(A) se fija al resto de los 3′ UTR, así como identificar el PAS utilizado por cualquier transcripción dada. El advenimiento de la secuenciación de próxima generación ha dado como resultado la identificación simultánea de 3′ UTRs y el paso de miles de genes. Este aumento en la capacidad de secuenciación ha requerido el desarrollo de algoritmos bioinformáticos para analizar los datos que implica alternativa poliadenilación del extremo 3′. Para la detección de novo o validación del PAS y por lo tanto, mapeo del extremo 3′ de los genes individuales de datos de secuenciación a gran escala, 3′ carrera sigue siendo el método de elección^4,5. Las secuencias incluidas en productos de cDNA de 3′ raza normalmente incluyen sólo una parte de los 3′ UTR que contiene la cola de poly(A), el sitio de la hendidura, el PAS y las secuencias aguas arriba del PAS. A diferencia de la polimerización en cadena, que requiere el diseño y uso de iniciadores específicos de avance y retroceso de gen, 3′ RACE sólo requiere iniciadores adelante anidados específicos de dos genes. Por lo tanto, la PCR requiere un conocimiento más detallado de la secuencia de nucleótidos de una región grande del gen está amplificado^4,6. 3′ carrera utiliza el mismo invertir cartilla que metas la poly(A) de la cola para todos contra RNA transcripciones, sólo los iniciadores hacia adelantados tienen que ser gene específico, así, que solo requieren conocimiento de una región significativamente menor del mRNA. Esto permite la amplificación de regiones cuyas secuencias no están completamente caracterizadas^4,7. Esto ha permitido 3′ carrera a utilizarse no sólo para determinar el extremo 3′ de un gen, sino para también determinar y caracterizar grandes regiones corriente arriba del PAS que forman una parte importante de los 3′ UTR. Al combinar la carrera con el modificado 3′ carrera que incluye grandes porciones de 3′ UTR y regiones flanqueantes 5′, es posible totalmente la secuencia o clonar una toda transcripción de mRNA del extremo 5′ a sus 3′ extremo⁸.

Un ejemplo de esta aplicación del modificado 3′ RACE es la reciente identificación de una novela CCND1 MRCK transcripción del gene de fusión de líneas de células del manto linfoma y pacientes con cáncer. El 3′ UTR consistió en secuencias de genes CCND1 y de MRCK y era recalcitrante a miRNA Reglamento⁹. Los dos anidados CCND1 específicos hacia adelante fueron complementarias a la región inmediatamente adyacente y aguas abajo del codón de parada CCND1 . Aunque transcriptoma toda la secuencia junto con herramientas bioinformáticas específico se puede utilizar para detectar fusiones de genes dentro de los 3′ UTR¹⁰, muchos laboratorios pueden carecer los recursos financieros o conocimientos de bioinformática para hacer uso de esta tecnología. Por lo tanto, 3′ RACE es una alternativa para novo de identificación y validación de genes de fusión novedosa que implica el 3′ UTR. Teniendo en cuenta el drástico aumento del número de genes de fusión reportado como Lee las transcripciones, 3′ RACE se ha convertido en una poderosa herramienta en la caracterización de secuencias de genes^11,12. Además, estudios recientes han demostrado que diferentes secuencias dentro de los 3′ UTR como la longitud de los 3′ UTR puede afectar estabilidad transcripción ARNm, localización, traducción y función¹³. Debido en parte a un creciente interés en la cartografía el transcriptoma, ha habido un aumento en el número de diferentes polimerasas de la DNA ser desarrollado para su uso en el laboratorio. Es importante determinar qué tipos de modificaciones pueden hacerse a los 3′ protocolo de la raza en el fin de utilizar el repertorio disponible de polimerasas de la DNA.

Este trabajo informes de adaptación de raza para asignar los enteros 3′ UTR 3′, el PAS y el 3′ final sitio de la hendidura de la transcripción de ANKHD1 utilizando anidados primers dentro de la sección ANKHD1 de la transcripción y dos diferentes polimerasas de la DNA.